本發(fā)明涉及適于調(diào)節(jié)或抑制cbl-b活性的雜環(huán)化合物或其可藥用的鹽。本發(fā)明還涉及制備此雜環(huán)化合物的方法。本發(fā)明進一步涉及用于治療和/或預(yù)防由該蛋白介導的疾病，特別是癌癥的方法。

背景技術(shù)：

1、cbl-b(casitas?b-lineage?lymphoma?proto-oncogene-b)是一種ring?e3連接酶，與cbl和cbl-c共同組成cbl家族。cbl-b蛋白包括幾個結(jié)構(gòu)區(qū)域，即n端的酪氨酸激酶結(jié)合(tkb，tyrosine?kinase?binding)結(jié)構(gòu)域、螺旋接頭(l，helical?linker)結(jié)構(gòu)域、環(huán)指(rf，ring?finger)結(jié)構(gòu)域，然后是pr區(qū)(proline?rich?motif)和c端的uba結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-associated?domain)。cbl-b通過其tbk結(jié)構(gòu)域與活化的酪氨酸激酶相互作用，使之位于l結(jié)構(gòu)域的y363被磷酸化，從而發(fā)生構(gòu)象變化。當cbl-b處于活化構(gòu)象時，其tkb結(jié)構(gòu)域?qū)f結(jié)構(gòu)域的掩蔽被解除，促使rf結(jié)構(gòu)域募集e2泛素結(jié)合酶，并介導底物的泛素化及降解。與cbl-b的tbk結(jié)構(gòu)域相互作用的酪氨酸激酶為t細胞受體(tcr)信號傳導所必需的蛋白，例如zap70、pkcθ和pi3k等，其降解導致tcr的信號被終止，從而抑制t細胞活化。cbl-b敲除小鼠具有過度活躍的t細胞，其適應(yīng)性和先天性抗腫瘤免疫增強。因此，cbl-b對tcr信號傳導起負調(diào)控的作用，其抑制劑有望用于癌癥的免疫治療。

2、發(fā)明的詳細說明

3、定義

4、除非另有陳述，否則本技術(shù)中所用的下列術(shù)語具有下述含義。

5、“cx-y”表示碳原子數(shù)的范圍，其中x和y均為整數(shù)，例如c3-8環(huán)烷基表示具有3-8個碳原子的環(huán)烷基，即具有3、4、5、6、7或8個碳原子的環(huán)烷基。還應(yīng)理解，“c3-8”還包含其中的任意亞范圍，例如c3-7、c3-6、c4-7、c4-6、c5-6等。

6、“烷基”指含有1至20個碳原子，例如1至8個碳原子、1至6個碳原子或1至4個碳原子的飽和的直鏈或支鏈的烴基基團。烷基的非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基等。

7、“環(huán)烷基”指含有3至14個碳環(huán)原子的飽和環(huán)狀烴基取代基。環(huán)烷基可以是單碳環(huán)，通常含有3至8個、3至7個或3至6個碳環(huán)原子。單環(huán)環(huán)烷基的非限制性實例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基等。環(huán)烷基還可以是稠合、橋接或螺合到一起的雙或三環(huán)，如十氫萘基、二環(huán)[2.2.2]辛烷、螺[3.3]庚烷等。

8、“雜環(huán)基或雜環(huán)”指飽和或部分不飽和的單環(huán)或多環(huán)環(huán)狀基團，其包括3至20個環(huán)原子，例如可以是3至14個、3至12個、3至10個、3至8個、3至6個或5至6個環(huán)原子，其中一個或多個環(huán)原子選自氮、氧或s(o)m(其中m是整數(shù)0至2)，其余環(huán)原子為碳。優(yōu)選包括3至12個環(huán)原子，3至10個環(huán)原子，4至7個環(huán)原子，4至6個環(huán)原子，其中1～4個是雜原子，1～3個是雜原子，或1～2個是雜原子。單環(huán)雜環(huán)基的非限制性實例包含噁丁環(huán)基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、吖丁啶基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、高哌嗪基、1,4-氧氮雜卓基、吡咯烷酮基、哌啶酮基、1,1-二氧化硫代嗎啉基等。多環(huán)雜環(huán)基包括稠、橋或螺多環(huán)雜環(huán)基，如八氫環(huán)戊二烯并[c]吡咯、八氫吡咯并[1,2-a]吡嗪、3,8-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷、5-氮雜螺[2.4]庚烷、2-氧雜-7-氮雜螺[3.5]壬烷等。

9、“芳基或芳環(huán)”指含有6至14個碳原子的芳香族單環(huán)或稠合多環(huán)基團，優(yōu)選為6至10元，例如苯基和萘基，最優(yōu)選苯基。所述芳基環(huán)可以稠合于雜芳基、雜環(huán)基或環(huán)烷基環(huán)上，其中與母體結(jié)構(gòu)連接在一起的環(huán)為芳基環(huán)，非限制性實例包括：

10、等。

11、“雜芳基或雜芳環(huán)”指包含5至14個環(huán)原子的雜芳族體系，其中1至4個環(huán)原子選自包括氧、硫和氮的雜原子。雜芳基優(yōu)選為5至10元，更優(yōu)選雜芳基是5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、異吲哚基等。雜芳基環(huán)可以稠合于芳基、雜環(huán)基或環(huán)烷基環(huán)上，非限制性實例包括：

12、等。

13、“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

14、“氰基”指-cn。

15、“氧代”指＝o。

16、“羰基”指-c(o)-基團。

17、“磺?；敝?s(o)2-基團。

18、“亞硫?；敝?s(o)-基團。

19、“任選”意味著隨后所描述的事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生。例如，“苯基的一個或多個氫任選被鹵素所取代”的描述包括苯基的一個或多個氫被鹵素取代的情形和不被鹵素取代的情形。

20、“取代”指基團中的一個或多個氫原子，優(yōu)選為1～5個，例如1～3個氫原子，獨立地被相應(yīng)數(shù)目的取代基所取代。取代基僅處在本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的可能的化學位置。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和鍵的碳原子(如烯烴)結(jié)合時可能是不穩(wěn)定的。取代基包括但不限于鹵素、氰基、硝基、羥基、氨基、氧代、-sf5、c1-4烷基、c3-7環(huán)烷基、4-7元雜環(huán)基、苯基、5-6元雜芳基等。

21、“異構(gòu)體”指具有相同分子式但其原子的結(jié)合位置或空間排列不同的化合物。原子空間排列不同的異構(gòu)體稱為“立體異構(gòu)體”。立體異構(gòu)體包括旋光異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和構(gòu)象異構(gòu)體。

22、本發(fā)明的化合物可以以旋光異構(gòu)體形式存在。旋光異構(gòu)體包括對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體。對映異構(gòu)體是指彼此不可重疊且互為鏡像的兩個立體異構(gòu)體。外消旋混合物或外消旋體是指具有相等數(shù)量的左旋和右旋對映異構(gòu)體的手性分子混合物。非對映異構(gòu)體是指彼此不可重疊且互不鏡像的兩個立體異構(gòu)體。當旋光異構(gòu)體為單一異構(gòu)體且其絕對構(gòu)型確定，根據(jù)手性原子上取代基的構(gòu)型，將其稱為“r”或“s”的異構(gòu)體；當未確定其絕對構(gòu)型時，根據(jù)其測得的旋光度值將其稱為(+)或(-)異構(gòu)體。制備和分離旋光異構(gòu)體的方法是本領(lǐng)域中已知的。

23、本發(fā)明的化合物還可具有由取代基在碳-碳雙鍵、碳-氮雙鍵、環(huán)烷基或雜環(huán)基周圍分布不同的幾何異構(gòu)體。碳-碳雙鍵或碳-氮鍵周圍的取代基被指定為z或e構(gòu)型，而環(huán)烷基或雜環(huán)周圍的取代基被指定為順式或反式構(gòu)型。

24、本發(fā)明的化合物還可能顯示互變異構(gòu)現(xiàn)象，例如酮-烯醇互變異構(gòu)。

25、應(yīng)該理解，本發(fā)明包括任何互變異構(gòu)或立體異構(gòu)形式及其混合物，并且不僅僅限于化合物的命名或化學結(jié)構(gòu)式中所使用的任何一個互變異構(gòu)或立體異構(gòu)形式。

26、“同位素”是指在本發(fā)明化合物中出現(xiàn)的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序數(shù)但不同質(zhì)量數(shù)的那些原子。適合并入本發(fā)明化合物中的同位素的實例是氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯，分別例如但不限于2h(d)、3h、13c、14c、15n、17o、18o、31p、32p、35s、18f和36cl。本發(fā)明的同位素標記化合物通?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)技術(shù)或通過與所附實施例中描述的那些類似的方法使用適當?shù)耐凰貥擞浀脑噭┐娣峭凰貥擞浀脑噭﹣碇苽?。這樣的化合物具有多種潛在用途，例如作為測定生物活性中的標樣和試劑。就穩(wěn)定同位素而言，例如氘2h(d)、13c和15n，含有此類同位素的化合物具有改變生物學、藥理或藥代動力學性質(zhì)的潛力。氘2h(d)為本發(fā)明的優(yōu)選同位素，例如甲基、亞甲基或次甲基中的氫可被氘取代。

27、本發(fā)明的化合物可以以前藥的形式給予?！扒八帯笔侵冈诨铙w內(nèi)的生理條件下例如通過氧化、還原、水解等(它們各自利用酶或在沒有酶參與下進行)轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的生物活性化合物的衍生物。前藥的實例有下述化合物：其中本發(fā)明的化合物中的氨基被?；?、烷基化或磷酸化，例如二十烷?；被⒈滨０被?、新戊酰氧基甲基氨基，或其中羥基被?；?、烷基化、磷酸化或轉(zhuǎn)化成硼酸鹽，例如乙酰氧基、棕櫚酰氧基、新戊酰氧基、琥珀酰氧基、富馬酰氧基、丙氨酰氧基，或其中羧基被酯化或酰胺化，或其中巰基與選擇性地向靶和/或向細胞的胞質(zhì)溶膠遞送藥物的載體分子。這些化合物可以由本發(fā)明的化合物根據(jù)公知方法制備。

28、“可藥用的鹽”或“藥學上可接受的鹽”是指在本發(fā)明的化合物含有一個或多個酸性或堿性基團的情況下，由可藥用的堿或酸，包括無機堿或酸和有機堿或酸制成的鹽。因此，含有酸性基團的本發(fā)明的化合物可以以鹽形式存在，例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽。這樣的鹽的更確切實例包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或與氨或有機胺，例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的鹽。含有堿性基團的本發(fā)明的化合物可以以無機酸或有機酸鹽形式存在。合適的酸的實例包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、特戊酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、異煙酸、檸檬酸、己二酸和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它酸。如果本發(fā)明的化合物在分子中同時含有酸性和堿性基團，本發(fā)明除所提到的鹽形式外還包括內(nèi)鹽或內(nèi)銨鹽。各鹽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，例如通過在溶劑或分散劑中使化合物與有機或無機酸或堿混合或通過與其它鹽的陰離子或陽離子交換獲得。

29、“藥物組合物”指含有一種或多種本發(fā)明的化合物或其可藥用的鹽、穩(wěn)定同位素衍生物、異構(gòu)體、前藥及其混合物形式以及其他組分，例如可藥用的載體和輔料的混合物。

30、因此，在本技術(shù)中當提及“化合物”、“本發(fā)明化合物”或“本發(fā)明所述化合物”時，包括所有所述化合物形式，例如其可藥用的鹽、穩(wěn)定同位素衍生物、異構(gòu)體、前藥及其混合物。

31、“治療有效量”指可以有效抑制cbl-b活性，達到治療或預(yù)防由其介導的疾病的本發(fā)明的化合物的量。

32、“患者”是指哺乳動物，尤其是人類。

33、本發(fā)明提供了可用作cbl-b抑制劑的化合物?；衔锶缤ㄊ?i)所示，或其前藥、穩(wěn)定同位素衍生物、可藥用的鹽及其異構(gòu)體：

34、

35、其中：

36、環(huán)a為苯環(huán)或6元雜芳環(huán)，所述苯環(huán)和雜芳環(huán)的一個或二個氫任選被鹵素、氰基、-oc1-6烷基、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-8元雜環(huán)基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被d或f所取代；

37、環(huán)b為苯環(huán)或5-6元雜芳環(huán)，所述苯環(huán)或雜芳環(huán)的一個或二個氫任選被鹵素、氰基、-c(o)nh2、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被d或f所取代；

38、環(huán)c為5-6元雜芳環(huán)，所述雜芳環(huán)的一個或二個氫任選被鹵素、氰基、氧代、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被d或f所取代；

39、x1和x2各自獨立選自cr1或n；

40、z1、z2、z3和z4各自獨立選自cr2或n；

41、l為鍵、-o-、-nr3-或

42、r為鹵素、氰基、rc、-orc、-nrcrd；

43、r1為鹵素、氰基、r′或-or′；

44、r2為鹵素、氰基、r′、-or′或-nr′r″；

45、r3為h、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基；

46、ra和rb各自獨立選自h、d、鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基，或者ra和rb及其相連的碳原子一起任選形成c3-6環(huán)烷烴或4-8元雜環(huán)；

47、rc和rd各自獨立選自h、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-10元雜環(huán)基，所述烷基、環(huán)烷基和雜環(huán)基的一個或多個氫任選被r″′所取代；

48、r′和r″各自獨立選自h、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-8元雜環(huán)基，所述烷基、環(huán)烷基和雜環(huán)基的一個或多個氫任選被d、鹵素、氰基或-oc1-6烷基所取代；且

49、r″′為d、鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-8元雜環(huán)基，其中所述烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基的一個或多個氫任選被鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基或c1-6烷基所取代。

50、在一些實施方案中，環(huán)a為苯環(huán)、吡啶環(huán)、噠嗪環(huán)或嘧啶環(huán)，所述苯環(huán)和雜芳環(huán)的一個或二個氫任選被鹵素、氰基、-oc1-2烷基、c1-2烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被d或f所取代。

51、在一些實施方案中，環(huán)b為苯環(huán)或6元雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、嘧啶環(huán)、噠嗪環(huán)或吡嗪環(huán)，所述苯環(huán)或雜芳環(huán)的一個或二個氫任選被鹵素、氰基、-c(o)nh2、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選被d或f所取代。

52、在一些實施方案中，環(huán)b為5元雜芳環(huán)，例如吡唑環(huán)、噻二唑環(huán)或三唑環(huán)，所述雜芳環(huán)的一個氫任選被c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被d或f所取代。

53、在一些實施方案中，環(huán)c為含有1-4個n、o和s任選雜原子的5元雜芳環(huán)，例如呋喃環(huán)、吡咯環(huán)、噻吩環(huán)、吡唑環(huán)、咪唑環(huán)、惡唑環(huán)、異惡唑環(huán)、噻唑環(huán)、異噻唑環(huán)、三唑環(huán)、惡二唑環(huán)或噻二唑環(huán)，所述雜芳環(huán)的一個氫任選被鹵素、氰基、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被d或f所取代。

54、在一些實施方案中，環(huán)c為三唑環(huán)、異惡唑環(huán)、吡唑環(huán)或噻二唑環(huán)，所述雜芳環(huán)的一個氫任選被c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被d或f所取代。

55、在一些實施方案中，x1和x2各自獨立選自ch或n。

56、在一些實施方案中，z1、z2、z3和z4為cr2。在一些實施方案中，z1為n，z2、z3和z4為cr2。在一些實施方案中，z2為n，z1、z3和z4為cr2。在一些實施方案中，z3為n，z1、z2和z4為cr2。在一些實施方案中，z4為n，z1、z2和z3為cr2。在一些實施方案中，z1和z4為n，z2和z3為cr2。在一些實施方案中，z1和z3為n，z2和z4為cr2。

57、在一些實施方案中，r2為鹵素、氰基、r′、-or′或-nr′r″；r′和r″各自獨立選自h、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基，所述烷基的一個或多個氫任選被d、鹵素、氰基或-oc1-6烷基所取代。

58、在一些實施方案中，l為鍵；r為h、鹵素、氰基、c3-8環(huán)烷基或4-10元雜環(huán)基，其中所述環(huán)烷基和雜環(huán)基的一個或多個氫任選被鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基或c1-6烷基所取代。

59、在一些實施方案中，l為-o-或-nr3-；r3為h、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基；r為h、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-10元雜環(huán)基，其中所述烷基、環(huán)烷基和雜環(huán)基的一個或多個氫任選被r″′所取代；r″′為d、鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基、4-8元雜環(huán)基，其中所述烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基的一個或多個氫任選被鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基或c1-6烷基所取代。

60、在一些實施方案中，l為ra和rb各自獨立選自h、d、鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基，或者ra和rb及其相連的碳原子一起任選形成c3-6環(huán)烷烴或4-8元雜環(huán)；r為氰基、rc、-orc、-nrcrd；rc和rd各自獨立選自h、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-10元雜環(huán)基，其中所述烷基、環(huán)烷基和雜環(huán)基的一個或多個氫任選被r″′所取代；r″′為d、鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-8元雜環(huán)基，其中所述烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基的一個或多個氫任選被鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基或c1-6烷基所取代。

61、在一些實施方案中，本發(fā)明的化合物如通式(ii)所示：

62、

63、其中：

64、ra和rb各自獨立選自h、d、鹵素或c1-6烷基；

65、r11為h、c1-6烷基、c3-8環(huán)烷基或4-8元雜環(huán)基，其中所述烷基、環(huán)烷基和雜環(huán)基的一個或多個氫任選被r″′所取代；

66、r12為h、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基；

67、r11和r12及其相連的氮原子一起任選形成任選含有額外1個o或n雜原子的4-10元雜環(huán)，包括但不限于氮雜環(huán)丁烷、吡咯烷、哌啶、氮雜環(huán)庚烷、嗎啉、哌嗪、所述雜環(huán)的一個或多個氫任選被d、鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基所取代，其中所述烷基的一個或多個氫任選進一步被鹵素、氰基、-oh、-oc1-6烷基或c1-6烷基所取代。

68、環(huán)a、環(huán)b、環(huán)c、x1、x2、z1、z2、z3、z4和r″′如通式(i)中所定義。

69、在一些實施方案中，本發(fā)明的化合物如通式(iii)所示：

70、

71、其中：

72、y1、y2和y3各自獨立選自ch或n；

73、r13為h、鹵素、氰基、-c(o)nh2、-oc1-6烷基、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基，其中所述烷基的一個或多個氫任選被d或f所取代；

74、環(huán)a、環(huán)c、x1、x2、z1、z2、z3、z4、r11、r12、ra、rb如通式(ii)中所定義。

75、在一些實施方案中，環(huán)c為五元雜芳環(huán)，包括但不限于優(yōu)選為r14為h、c1-6烷基或c3-8環(huán)烷基，其中所述烷基的一個或多個氫任選被d或f所取代；

76、本發(fā)明還涉及以下化合物，或其可藥用的鹽、穩(wěn)定同位素衍生物、異構(gòu)體、前藥及其混合物：

77、

78、

79、

80、

81、

82、

83、

84、

85、

86、

87、

88、

89、

90、本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含通式(i)所示的化合物或其可藥用的鹽、穩(wěn)定同位素衍生物、異構(gòu)體及前藥和一種或多種藥學上可接受的載體或輔料。所述藥物組合物可抑制cbl-b的活性，影響其生物學功能，從而達到治療或者預(yù)防cbl-b介導的疾病的效果。

91、本發(fā)明還提供一種用于治療或者預(yù)防cbl-b介導的疾病的方法，所述方法包括給予有需要的患者治療有效量的通式(i)所示的化合物或其可藥用的鹽、穩(wěn)定同位素衍生物、異構(gòu)體、前藥及其藥物組合物；所述的“有效量”是通過改善疾病的病理狀態(tài)或減輕疾病的癥狀來治療疾病的有效劑量；所述疾病包括但不限于血液瘤(如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)和實體瘤(如膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、膽管癌、胃癌、食道癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、尿路上皮癌、肌肉癌、骨癌等)。

92、本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-8任一項所述的化合物或其可藥用的鹽、穩(wěn)定同位素衍生物、異構(gòu)體和至少一種額外的藥物，其中所述額外的藥物包括但不限于化療藥、激酶抑制劑、合成致死劑、免疫和/或炎癥調(diào)節(jié)劑、神經(jīng)相關(guān)疾病調(diào)節(jié)劑等。

93、根據(jù)本發(fā)明，所述藥物可以是任何藥物劑型，包括但不限于片劑、膠囊劑、溶液劑、凍干制劑、注射劑。

94、本發(fā)明的藥物制劑可以以預(yù)定量的活性成分的劑量單位形式給藥。根據(jù)治療的病癥、給藥方法和患者的年齡、體重和狀況，這樣的單位包含有1毫克至1000毫克的本發(fā)明的化合物。此外，所述藥物制劑可以使用藥學領(lǐng)域眾所周知的方法制備，例如通過將活性成分與一種或多種輔料或一種或多種佐劑一起配制。

95、本發(fā)明藥物制劑可適于通過任何所需的合適方法給藥，例如通過經(jīng)口(包括口腔或舌下)、直腸、經(jīng)鼻、局部(包括口腔、舌下或經(jīng)皮)或腸道外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))方法給藥。

96、本發(fā)明還提供化合物的制備方法。化合物也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的合成技術(shù)合成。每步反應(yīng)所得的產(chǎn)物用本領(lǐng)域已知的分離技術(shù)得到。合成所需的起始原料和化學試劑可以根據(jù)文獻(可從scifinder上查詢)常規(guī)合成或購買。

97、合成方法

98、本發(fā)明通式(i)所述雜環(huán)類化合物可按照下方所述路線合成：p-1被boc保護后，然后通過鈀催化的偶聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為p-3；p-3經(jīng)鹵代反應(yīng)得到p-4，然后進一步通過取代反應(yīng)得到p-5；p-5和o-1通過鈀催化的偶聯(lián)反應(yīng)得到i。

99、

100、中間體p-5也可按照下述路線合成：p-1經(jīng)鈀催化的交叉偶聯(lián)反應(yīng)直接得到p-5。

101、

102、中間體p-1可按照下述路線合成：p-11經(jīng)溴化得到p-12，p-12經(jīng)取代反應(yīng)得到p-13，然后通過重排反應(yīng)得到p-1。

103、

104、中間體o-1可按照下述路線合成：羧酸o-11經(jīng)縮合反應(yīng)得到o-12，o-12可進一步環(huán)化得到o-13。o-13經(jīng)還原反應(yīng)和交叉偶聯(lián)反應(yīng)得到o-15，o-15可進一步衍生化得到o-1。

105、

106、以下實施例進一步說明本發(fā)明。這些實施例僅旨在說明本發(fā)明而不應(yīng)被認為是對本發(fā)明范圍的限制。

107、實施例

108、本發(fā)明的起始原料可以按照本領(lǐng)域已知的方法來合成，或可購自abcr?gmbh&co.kg、acros?organics、aldrich?chemical?company、韶遠化學科技(accela?chembioinc.)、北京偶合、畢得醫(yī)藥、澤升科技等化學品公司。

109、本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)是通過核磁共振(nmr)和/或質(zhì)譜(ms)來確定的。nmr的測定使用bruker?ascend-400核磁儀，所用溶劑為氘代二甲基亞砜(dmso-d6)、氘代氯仿(cdc13)或氘代甲醇(cd3od)等，內(nèi)標為四甲基甲硅烷(tms)，化學位移是以10-6(ppm)作為單位給出。ms的測定使用agilent?sqd(esi)質(zhì)譜儀(安捷倫6120)。

110、hplc使用安捷倫1260dad高壓液相色譜儀(poroshell?120?ec-c18，50×3.0mm，2.7μm色譜柱)或waters?arc高壓液相色譜儀(sunfirc?c18，150×4.6mm，5μm色譜柱)。

111、實施例中如無特殊說明，反應(yīng)溫度為室溫(20℃-30℃)。

112、實施例中如無特殊說明，反應(yīng)均在氬氣或氮氣氣氛下進行。氬氣或氮氣氣氛是指反應(yīng)瓶在抽真空再充入氬氣或氮氣(反復(fù)3次)后，連接一個約1l容積的氬氣或氮氣氣球。

113、氫氣氣氛是指反應(yīng)瓶在抽真空再充入氫氣(反復(fù)3次)后，連接一個約1l容積的氫氣氣球。

114、微波反應(yīng)使用cem?discover-sp型微波反應(yīng)器。

115、實施例中的反應(yīng)進程的監(jiān)測使用安捷倫的液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(1260/6120)，也可采用薄層層析(tlc)，所用硅膠板的厚度為0.15～0.2mm(青島海洋gf254)。

116、化合物的純化采用柱層析或薄層層析，其中柱層析使用青島海洋的200～300目硅膠，薄層層析使用青島海洋的厚度為0.4～0.5mm的gf254硅膠板。

117、柱層析或薄層層析展開溶劑體系通常有a)二氯甲烷和甲醇體系，b)石油醚和乙酸乙酯體系，或如實施例中所示。溶劑的體積比根據(jù)化合物的極性不同而進行調(diào)節(jié)，也可以加入少量的三乙胺、或其它酸性或堿性試劑進一步調(diào)節(jié)。

118、化合物的純化還采用waters的質(zhì)譜導向自動制備系統(tǒng)(質(zhì)譜檢測器：sqd2，簡稱prep-hplc)，根據(jù)化合物的極性用適當?shù)囊译?水(含0.1％三氟乙酸或甲酸，或0.05％氨水)梯度于20ml/min的流速洗脫反相高壓柱(xbridge-c18，19×150mm，5μm)。部分實施例可在使用自動制備系統(tǒng)純化后加入1n稀鹽酸，然后減壓除去溶劑，得到鹽酸鹽。

119、縮寫dmf是指n,n-二甲基甲酰胺。

120、縮寫dma是指n,n-二甲基乙酰胺。

121、縮寫nmp是指n-甲基吡咯烷酮。

122、縮寫thf是指四氫呋喃。

123、縮寫dipea是指n,n-二異丙基乙胺。

124、縮寫dmap是指對n,n-二甲氨基吡啶。

125、縮寫nbs是指n-溴代琥珀酰亞胺。

126、縮寫nis是指n-碘代琥珀酰亞胺。

127、縮寫hatu是指2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽。

128、縮寫xantphos是指4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽。

129、縮寫xphos是指2-二環(huán)己基磷-2',4',6'-三異丙基聯(lián)苯。

130、實施例1

131、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-甲基-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物1)

132、

133、第一步

134、2-溴-5-氰基苯甲酸(1b)

135、將2-溴-5-氰基苯甲酸甲酯1a(4.80g，25mmol)和lioh·h2o(4.20g，100mmol)溶解在thf(50ml)和水(50ml)的混合溶劑中。攪拌2小時后，向混合物中加入稀鹽酸(2n，100ml)，然后用乙酸乙酯(200ml)萃取。有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，得到目標產(chǎn)物1b(4.52g)。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

136、ms?m/z(esi):226,228[m+1]

137、第二步

138、2-(2-溴-5-氰基苯甲?；?-n-甲基肼-1-硫代甲酰胺(1c)

139、向1b(4.52g，粗品，約25mmol)的dmf(50ml)溶液中依次加入n-甲基肼碳硫酰胺(2.89g，27.5mmol)、hatu(11.41g，30mmol)和dipea(13ml，75mmol)，然后攪拌1小時。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

140、ms?m/z(esi):313,315[m+1]

141、第三步

142、4-溴-3-(4-甲基-5-硫代-4,5-二氫-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(1d)

143、向第二步反應(yīng)溶液中加入飽和碳酸氫鈉溶液(50ml)，然后加熱至80℃并攪拌14小時。冷卻至室溫后，加入稀鹽酸(2n，100ml)，然后過濾。收集沉淀物并干燥后，得到目標產(chǎn)物1d(4.83g，65％)。

144、ms?m/z(esi):295,297[m+1]

145、第四步

146、4-溴-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(1e)

147、0℃下向1d(4.72g，16mmol)的二氯甲烷(60ml)溶液中加入乙酸(9ml)和雙氧水溶液(30％，7.5ml)。所得混合物在0℃下攪拌1小時后，加入飽和碳酸氫鈉溶液(100ml)，然后用二氯甲烷(3×100ml)萃取。有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，得到目標產(chǎn)物1e(3.95g)。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

148、ms?m/z(esi):263,265[m+1]

149、第五步

150、4-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(1f)

151、將1e(3.95g，粗品，約15mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(60ml)和水(15ml)中，加入pd(dppf)cl2(1.10g，1.5mmol)、碳酸鉀(6.22g，45mmol)和(2,6-二氯吡啶-4-基)硼酸(3.45g，18mmol)，并在氮氣保護下加熱至60℃攪拌13小時。冷卻到室溫后，加入水(100ml)，然后用乙酸乙酯(200ml)萃取。濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝1/0至9/1)純化，得到目標產(chǎn)物1f(1.64g，33％)。

152、ms?m/z(esi):330[m+1]

153、第六步

154、(r)-4-(4-(1-(4-(氯甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-3-氟芐腈(1g)

155、將1f(1.65g，5mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(20ml)和水(5ml)中，加入pd(dppf)cl2(366mg，6mmol)、碳酸鉀(2.07g，15mmol)和環(huán)丙基硼酸(515mg，18mmol)，并在氮氣保護下加熱至100℃攪拌16小時。冷卻到室溫后，加入水(100ml)，然后用乙酸乙酯(200ml)萃取。濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝1/0至9/1)純化，得到目標產(chǎn)物1g(1.46g，87％)。

156、ms?m/z(esi):336[m+1]

157、第七步

158、5-溴-1h,3h-苯并[de]異色烯-1,3-二酮(1i)

159、室溫下向1h,3h-苯并[de]1,3-二酮異色烯1h(10g，50.5mmol)、硫酸銀(7.84g，25.1mmol)和濃硫酸(200ml)的混合物中加入br2(10.16g，63.6mmol)。所得混合物加熱到60℃并攪拌12小時，冷卻至室溫后，過濾收集濾液，將濾液加入到冰水中并攪拌20分鐘，過濾收集固體得到目標產(chǎn)物1i(12.5g，90％)。

160、ms?m/z(esi):277,279[m+1]

161、第八步

162、5-溴-1,3-二氧-1h-苯并[de]異喹啉-2(3h)-基4-甲基苯磺酸基酯(1j)

163、向1i(12.5g，46.1mmol)的吡啶(100ml)溶液中加入鹽酸羥胺(3.1g，46.1mmol)，然后將混合物加熱至90℃并攪拌3小時。冷卻至80℃后，緩慢加入對甲苯磺酰氯(10.6g，57.2mmol)，加熱至90℃并攪拌3小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，得到目標產(chǎn)物1j(20.5g)。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

164、ms?m/z(esi):446,448[m+1]

165、第九步

166、4-溴苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(1k)

167、向1j(20.5g，粗品，約41.6mmol)和水(150ml)的混合物中加入氫氧化鈉(5.5g，138mmol)，所得混合物加熱至90℃并攪拌2小時。冷卻到室溫后，用1n鹽酸調(diào)節(jié)ph＝5，然后過濾。所得固體在50℃下干燥2小時，得到目標產(chǎn)物1k(9.78g，86％)。

168、ms?m/z(esi):248,250[m+1]

169、第十步

170、4-甲基苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(1l)

171、將1k(150mg，0.61mmol)溶解在thf(10ml)中，然后依次加入三甲基環(huán)三硼氧烷(3.5m的thf溶液)(0.35ml，1.22mmol)、pd(dppf)cl2·ch2cl2(99mg，0.12mmol)、碳酸鉀(334mg，2.44mmol)和水(0.5ml)。所得混合物在氮氣氣氛下加熱到100℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，用乙酸乙酯(3×15ml)萃取。合并的有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至2/1)純化，得到目標產(chǎn)物1l(90mg，81％)。

172、ms?m/z(esi):184[m+1]

173、第十一步

174、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-甲基-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(1)

175、將1l(60mg，0.33mmol)和1g(110mg，0.33mmol)溶解在甲苯(20ml)中，然后依次加入pd2(dba)3(30mg，0.033mmol)，xantphos(57mg，0.99mmol)和碳酸銫(213mg，0.65mmol)。所得混合物在氮氣氣氛下加熱到110℃并攪拌12小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至40/1)純化，然后用prep-hplc純化得到目標產(chǎn)物1(55mg，35％)。

176、ms?m/z(esi):483[m+1]

177、1h?nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.55(s,1h),8.29–8.19(m,2h),8.10(s,1h),8.02(s,1h),7.93(d,j＝8.5hz,1h),7.85(d,j＝7.2hz,1h),7.69(dd,j＝9.0,4.8hz,2h),7.61(dd,j＝8.3,7.3hz,1h),7.03(d,j＝1.3hz,1h),3.45(s,3h),2.64(s,3h),2.16(dd,j＝8.7,3.9hz,1h),1.10–0.93(m,4h).

178、實施例2

179、(s)-4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物2)

180、

181、第一步

182、(s)-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(2a)

183、向(溴甲基)三氟硼酸鉀(850mg，4.23mmol)和(s)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(574mg，4.23mmol)的thf(32ml)溶液中加入碳酸銫(2.76g，8.46mmol)，所得混合物加熱到80℃并攪拌5小時。冷卻至室溫后，向反應(yīng)依次加入1k(350mg，1.41mmol)、pd(oac)2(317mg，1.41mmol)、xphos(1.34g，2.82mmol)和水(8ml)。所得混合物在氮氣氣氛下加熱到90℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，用乙酸乙酯(3×15ml)萃取。合并的有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至40/1)純化，得到目標產(chǎn)物2a(270mg，68％)。

184、ms?m/z(esi):281[m+1]

185、第二步

186、(s)-4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(2)

187、向2a(135mg，0.48mmol)和1g(162mg，0.48mmol)的甲苯(20ml)溶液中依次加入pd2(dba)3(66mg，0.072mmol)、xantphos(84mg，0.15mmol)和碳酸銫(393mg，1.21mmol)。所得混合物加熱到110℃并攪拌12小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至20/1)純化，然后用prep-hplc再次純化得到目標產(chǎn)物2(100mg，36％，含0.35當量甲酸)。

188、ms?m/z(esi):580[m+1]

189、1h?nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.56(s,1h),8.29–8.21(m,2h),8.19(s,1h),8.14(s,0.35h,hcooh),8.10(s,1h),7.93(d,j＝8.6hz,1h),7.88(d,j＝7.3hz,1h),7.77(d,j＝8.4hz,1h),7.67(d,j＝1.0hz,1h),7.66–7.60(m,1h),7.04(d,j＝1.0hz,1h),3.76(d,j＝2.4hz,2h),3.46(s,3h),2.78(t,j＝12.1hz,2h),2.22–2.12(m,1h),1.97(t,j＝10.0hz,1h),1.73–1.41(m,5h),1.11–1.02(m,2h),1.02–0.94(m,2h),0.86(d,j＝7.4hz,1h),0.81(d,j＝6.2hz,3h).

190、實施例3

191、(s)-1-(6-環(huán)丙基-4-(1-甲基-4-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-1h-吡唑-5-基)吡啶-2-基)-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(化合物3)

192、

193、第一步

194、5-溴-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酸乙酯(3b)

195、0℃下向5-氨基-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酸乙酯3a(34g，200mmol)、溴化銅(66.9g，300mmol)和乙腈(400ml)中加入亞硝酸叔丁酯(24.7g，240mmol)。室溫并攪拌1小時，向混合物中加入6n鹽酸(860ml)并攪拌，然后用二氯甲烷萃取1次(300ml)。有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至20/1)純化，得到目標產(chǎn)物3b(41.6g，89％)。

196、ms?m/z(esi):233,235[m+1]

197、第二步

198、5-(2,6-二氯吡啶-4-基)-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酸乙酯(3c)

199、向3b(12g，51.5mmol)、(2,6-二氯吡啶-4-基)硼酸(9.9g，51.5mmol)、碳酸鉀(21.32g，154.5mmol)、1,4-二氧六環(huán)(430ml)和水(86ml)的混合物中加入pd(dppf)cl2·ch2cl2(3.76g，5.15mmol)。所得混合物在氮氣氣氛下加熱至60℃并攪拌5小時。冷卻至室溫后，混合物用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。合并的有機相無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝30/1至10/1)純化，得到目標產(chǎn)物3c(10.62g，69％)。

200、ms?m/z(esi):300[m+1]

201、第三步

202、5-(2,6-二氯吡啶-4-基)-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酸(3d)

203、將3c(6.8g，22.8mmol)溶于thf(91ml)和水(91ml)中，然后加入氫氧化鋰(2.9g，68.5mmol)。將混合物加熱至50℃并攪拌2小時。冷卻至室溫后，在減壓條件下濃縮至100ml，用2n鹽酸調(diào)節(jié)至ph＝4。通過過濾收集沉淀物，干燥箱50℃烘干，得到目標產(chǎn)物3d(4g，64％)。

204、ms?m/z(esi):272[m+1]

205、第四步

206、2-(5-(2,6-二氯吡啶-4-基)-1-甲基-1h-吡唑-4-羰基)-n-甲基肼-1-硫代甲酰胺(3e)

207、向3d(4g，14.7mmol)、dipea(3.8g，29.4mmol)、4-甲基氨基硫脲(1.7g，16.2mmol)和dmf(60ml)的混合物中加入hatu(6.1g，16.2mmol)。所得混合物在室溫下攪拌1小時，加入水(100ml)，然后用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。合并的有機相無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝20/1至3/1)純化，得到目標產(chǎn)物3e(4.5g，86％)。

208、ms?m/z(esi):359[m+1]

209、第五步

210、5-(5-(2,6-二氯吡啶-4-基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-硫醇(3f)

211、將3e(4.5g，12.5mmol)溶于水(125ml)，冷卻至0℃，然后加入氫氧化鈉(5g，12.5mmol)。將混合物在室溫下攪拌12小時。用2n鹽酸調(diào)節(jié)至ph＝4。通過過濾收集沉淀物，干燥箱50℃烘干，得到目標產(chǎn)物3f(3.25g，76％)。

212、ms?m/z(esi):341[m+1]

213、第六步

214、2,6-二氯-4-(1-甲基-4-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-1h-吡唑-5-基)吡啶(3g)

215、向3f(3.25g，9.5mmol)的二氯甲烷(35ml)溶液中加入雙氧水(30％，3.2g，95mmol)。所得混合物在室溫下攪拌2小時后，濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝50/1至10/1)純化，得到目標產(chǎn)物3g(1.6g，54％)。

216、ms?m/z(esi):309[m+1]

217、第七步

218、2-氯-6-環(huán)丙基-4-(1-甲基-4-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-1h-吡唑-5-基)吡啶(3h)

219、向3g(0.8g，2.6mmol)、環(huán)丙基硼酸(379mg，4.41mmol)、磷酸鉀(1.1g，5.2mmol)和1,4-二氧六環(huán)(26ml)的混合物中加入pd(dppf)cl2·ch2cl2(210mg，0.26mmol)。將混合物在氮氣氣氛下加熱至100℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。合并的有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝50/1至10/1)純化，得到目標產(chǎn)物3h(460mg，56％)。

220、ms?m/z(esi):315[m+1]

221、第八步

222、(s)-1-(6-環(huán)丙基-4-(1-甲基-4-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-1h-吡唑-5-基)吡啶-2-基)-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(3)

223、將3h(31.5mg，0.1mmol)、2a(28.1mg，0.1mmol)、醋酸鈀(1.7mg，0.01mmol)、xantphos(11.5mg，0.02mmol)、碳酸銫(98mg，0.3mmol)和1,4-二氧六環(huán)(2ml)混合在一個10-ml微波管里，用氮氣置換體系里的空氣，蓋上蓋子，置于微波反應(yīng)器中100℃加熱1小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至20/1)純化，然后用prep-hplc再次純化得到目標產(chǎn)物3(6.7mg，12％)。

224、ms?m/z(esi):559[m+1]

225、1h?nmr(400mhz,cd3od)δ8.68(s,1h),8.39(s,1h),8.24(s,1h),8.05(d,j＝7.2hz,1h),7.99(s,1h),7.91(d,j＝1.1hz,1h),7.82(d,j＝8.4hz,1h),7.72(t,j＝7.8hz,1h),7.32(d,j＝1.1hz,1h),4.64(s,2h),4.10(s,3h),3.63(s,3h),3.58–3.53(m,1h),3.49–3.43(m,1h),3.00(dd,j＝12.7,10.1hz,1h),2.82–2.66(m,1h),2.26(tt,j＝7.5,5.5hz,1h),2.04–1.95(m,1h),1.89(d,j＝10.6hz,2h),1.77(dd,j＝27.5,13.2hz,1h),1.21(dd,j＝12.7,5.6hz,1h),1.17–1.11(m,4h),1.00(d,j＝6.4hz,3h).

226、實施例4

227、3-(2,6-二氟苯基)-1-((4-(嗎啉-4-羰基)苯基)氨基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8(7h)-酮(化合物4)

228、

229、第一步

230、4-溴-6-氟苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(4a)

231、向1k(600mg，2.42mmol)的dmf(18ml)溶液中依次加入氟試劑(selectfluor，1.03g，2.90mmol)和冰醋酸(174mg，2.90mmol)。所得混合物加熱到90℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至4/1)純化，得到目標產(chǎn)物4a(150mg，23％)。

232、ms?m/z(esi):267,269[m+1]

233、第二步

234、(s)-6-氟-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(4b)

235、向(溴甲基)三氟硼酸鉀(340mg，1.69mmol)和(s)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(230mg，1.69mmol)的thf(16ml)溶液中加入碳酸銫(1.10g，3.38mmol)，混合物加熱到80℃并攪拌5小時。冷卻至室溫后，向混合物中依次加入4a(150mg，0.56mmol)、pd(oac)2(25mg，0.11mmol)、xphos(108mg，0.23mmol)和水(4ml)。所得混合物在氮氣氣氛下加熱到90℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，用乙酸乙酯(3×15ml)萃取。合并的有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至2/1)純化，得到目標產(chǎn)物4b(135mg，80％)。

236、ms?m/z(esi):299[m+1]

237、第三步

238、(s)-4-(2-環(huán)丙基-6-(6-氟-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(2)

239、向4b(100mg,，0.34mmol)、1g(113mg，0.34mmol)和甲苯(20ml)的混合物中依次加入pd2(dba)3(46mg，0.05mmol)、xantphos(58mg，0.10mmol)和碳酸銫(273mg，0.84mmol)。所得混合物在氮氣氣氛下加熱到110℃并攪拌12小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至20/1)純化，然后用prep-hplc再次純化得到目標產(chǎn)物4(19mg，含0.2當量甲酸，9.5％)。

240、ms?m/z(esi):598[m+1]

241、1h?nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.56(s,1h),8.24(dd,j＝5.8,4.0hz,3h),8.21(s,0.2h,hcooh),8.19(s,1h),7.93(d,j＝8.6hz,1h),7.85(dd,j＝8.1,3.2hz,1h),7.69(s,1h),7.44(dd,j＝11.6,8.1hz,1h),7.04(s,1h),3.78(s,2h),3.46(s,3h),2.75(d,j＝10.2hz,2h),2.17(s,1h),2.01–1.93(m,1h),1.66(d,j＝10.0hz,5h),1.06(d,j＝7.9hz,2h),0.98(s,2h),0.85(s,1h),0.81(d,j＝6.1hz,3h).

242、實施例5

243、(s)-1-(4-(4-氰基-2-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-6-環(huán)丙基吡啶-2-基)-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代-1,2-二氫苯并[cd]吲哚-6-腈(化合物5)

244、

245、第一步

246、4-溴-6-碘苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(5a)

247、向1k(1.00g，4.03mmol)的dmf(20ml)溶液中加入nis(2.27g，10.1mmol)。所得混合物加熱到120℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，混合物在減壓條件下濃縮至干，然后加入無水乙醇(20ml)并攪拌0.5小時。過濾后，收集濾餅得到目標產(chǎn)物5a(1.20g，80％)。

248、ms?m/z(esi):374,376[m+1]

249、第二步

250、4-溴-2-氧代-1,2-二氫苯并[cd]吲哚-6-腈(5b)

251、將5a(500mg，1.34mmol)、zn(cn)2(166mg，1.41mmol)、pd(pph)4(77mg，0.067mmol)和dmf(20ml)放入100-ml封管中，然后用氮氣置換空氣，加熱到80℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，加入乙酸乙酯(50ml)和水(50ml)并攪拌、分液，有機相在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至2/1)純化，得到目標產(chǎn)物5b(270mg，74％)。

252、ms?m/z(esi):273,275[m+1]

253、第三步

254、(s)-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代-1,2-二氫苯并[cd]吲哚-6-腈(5c)

255、將(溴甲基)三氟-4-硼烷鉀鹽(296mg，1.98mmol)、(s)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(398mg，1.98mmol)、碳酸銫(1.29g，3.96mmol)和thf(15ml)混合，加熱至80℃并攪拌16小時。冷卻到室溫后，向混合物中加入5b(270mg，0.99mmol)、pd(oac)2(17mg，0.099mmol)、xphos(94mg，0.198mmol)和水(2ml)。所得混合物加熱至80℃并攪拌16小時。冷卻至室溫后，過濾然后分液。有機相在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至6/1)純化，得到目標產(chǎn)物5c(170mg，56％)。

256、ms?m/z(esi):306[m+1]

257、第四步

258、(s)-1-(4-(4-氰基-2-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-6-環(huán)丙基吡啶-2-基)-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代-1,2-二氫苯并[cd]吲哚-6-腈(5)

259、將5c(70mg，0.23mmol)、pd2(dba)3(21mg，0.023mmol)、xantphos(27mg，0.046mmol)、碳酸銫(225mg，0.69mmol)、1g(77mg，0.23mmol)和甲苯(5ml)混合，在氮氣氣氛下加熱至110℃并攪拌16小時。冷卻至室溫后，在減壓條件下濃縮至干，殘余物先用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至5/1)純化，再用prep-hplc純化，得到目標產(chǎn)物5(19mg，14％)。

260、ms?m/z(esi):605[m+1]

261、1h?nmr(400mhz,cd3od)δ8.53(s,1h),8.25(d,j＝13.4hz,2h),8.12(ddd,j＝22.7,11.5,4.7hz,3h),7.97(dd,j＝10.4,7.9hz,2h),7.66(d,j＝1.3hz,1h),7.14(d,j＝1.3hz,1h),3.93(s,2h),3.49(s,3h),2.93(s,2h),2.23–2.11(m,2h),1.88(t,j＝10.2hz,1h),1.74(t,j＝13.2hz,4h),1.12–0.93(m,5h),0.89(d,j＝6.4hz,3h).

262、實施例6

263、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-(羥甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物6)

264、

265、第一步

266、(r)-4-(1-(4-(4-氰基-2-氟苯基)哌嗪-1-基)乙基)苯甲酸甲酯(6a)

267、室溫下向1k(9.78g，39.4mmol)和dmap(561mg，4.6mmol)的乙腈溶液中加入boc2o(1.05g，50.7mmol)。攪拌2小時，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至30/1)純化，得到目標產(chǎn)物6a(7.45g，54％)。

268、ms?m/z(esi):348,350[m+1]

269、第二步

270、4-(羥甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-羧酸叔丁酯(6b)

271、向6a(500mg，1.44mmol)和(三丁基錫)甲醇(695mg，2.16mmol)的dmf(10ml)溶液中加入pd(pph3)2cl2(100mg，0.144mmol)，然后加熱到100℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝20/1至10/1)純化，得到目標產(chǎn)物6b(329mg，77％)。

272、ms?m/z(esi):300[m+1]

273、第三步

274、4-(羥基甲基)-1h-苯并[cd]吲哚-2-酮(6c)

275、將6b(20mg，0.67mmol)溶解在氯化氫的乙醇溶液(2ml，2n)中，然后攪拌2小時。所得混合物減壓條件下濃縮至干，得到目標產(chǎn)物6c。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

276、ms?m/z(esi):200[m+1]

277、第四步

278、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-(羥甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(6)

279、在氮氣氣氛下將6c(20mg，粗品，約0.1mmol)、1g(38mg，0.1mmol)、pd2(dba)3(8mg，0.01mmol)、xantphos(12mg，0.02mmol)、碳酸銫(100mg，0.3mmol)和1,4-二氧六環(huán)(2ml)的混合物加熱至100℃并攪拌18小時。冷卻至室溫后，混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用prep-hplc純化得到目標產(chǎn)物6(0.88mg，17％)。

280、ms?m/z(esi):499[m+1]

281、1h?nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.56(s,1h),8.27–8.22(m,2h),8.12(s,1h),7.94(d,j＝8.6hz,1h),7.89(d,j＝7.2hz,1h),7.78(d,j＝8.4hz,1h),7.69(s,1h),7.68–7.61(m,1h),7.42–7.35(m,1h),7.03(s,1h),5.61–5.53(m,1h),4.82(d,j＝5.5hz,2h),3.46(s,3h),2.17(d,j＝4.3hz,1h),1.11–0.95(m,4h).

282、實施例7

283、(r)-4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物7)

284、

285、第一步

286、(4-(氯甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(7a)

287、向6b(329mg，1.1mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中加入氯化亞砜(69mg，0.58mmol)。所得混合物在室溫下攪拌2小時，濃縮至干，得到目標產(chǎn)物7a(240mg，1.1mmol)。

288、ms?m/z(esi):218[m+1]

289、第二步

290、(r)-4-((4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(7b)

291、向7a(31mg，0.14mmol)的dmf(1ml)溶液中依次加入(r)-4,4-二氟-3-甲基哌啶(27mg，0.16mmol)和碳酸銫(137mg，0.42mmol)，所得混合物加熱到60℃并攪拌1小時。冷卻到室溫后，過濾除去沉淀物，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至9/1)純化，得到目標產(chǎn)物7b(25mg，57％)。

292、ms?m/z(esi):317[m+1]

293、第三步

294、(r)-4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(7)

295、將7b(25mg，0.08mmol)、1g(50mg，0.15mmol)、pd2(dba)3(14mg，0.015mmol)、xantphos(17mg，0.03mmol)、碳酸銫(147mg，0.45mmol)和1,4-二氧六環(huán)(4ml)混合在一個10-ml微波管里，用氮氣置換體系里的空氣，蓋上蓋子，置于微波反應(yīng)器中100℃加熱1小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至9/1)純化，并用prep-hplc再次純化，得到目標產(chǎn)物7(26.2mg，54％)。

296、ms?m/z(esi):616[m+1]

297、1h?nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.55(s,1h),8.24(d,j＝6.6hz,3h),8.13(s,1h),7.93(d,j＝8.6hz,1h),7.89(d,j＝7.3hz,1h),7.79(d,j＝8.2hz,1h),7.67(s,2h),7.05(s,1h),3.84(s,2h),3.46(s,3h),2.78(s,3h),2.33(s,1h),2.12–1.91(m,4h),1.05(dd,j＝10.6,6.0hz,2h),0.98(s,2h),0.92(d,j＝5.8hz,3h).

298、以下化合物參照實施例7的實驗步驟操作合成，但在操作中用不同的化合物代替(r)-4,4-二氟-3-甲基哌啶。

299、

300、

301、

302、這些化合物的核磁數(shù)據(jù)如下：

303、

304、

305、

306、

307、實施例8

308、4-(2-環(huán)丙基-6-(2-氧代-4-(((四氫-2h-吡喃-4-基)氧基)甲基)苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物11)

309、

310、第一步

311、4-(((四氫-2h-吡喃-4-基)氧基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(11a)

312、0℃下向四氫吡喃-4-醇(6mg，0.66mmol)的dmf(1ml)溶液中加入氫化鈉(4.4mg，0.11mmol)。0℃下攪拌20分鐘后，向混合物中加入7a(7mg，0.02mmol)。室溫下攪拌2小時后，混合物用乙酸乙酯(20ml)稀釋，然后用飽和食鹽水(2×20ml)洗滌。有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至1/4)純化，得到目標產(chǎn)物11a(15mg，)。

313、ms?m/z(esi):284[m+1]

314、第二步

315、4-(2-環(huán)丙基-6-(2-氧代-4-(((四氫-2h-吡喃-4-基)氧基)甲基)苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(11)

316、將11a(10mg，0.04mmol)、1g(13mg，0.04mmol)、pd2(dba)3(3mg，0.004mmol)、xantphos(5mg，0.008mmol)、碳酸鉀(17mg，0.12mmol)和1,4-二氧六環(huán)(0.5ml)混合，然后在氮氣氣氛下加熱至100℃并攪拌3小時。冷卻至室溫后，混合物減壓條件下濃縮至干，殘余物用prep-hplc純化得到目標產(chǎn)物11(1.9mg，8％)。

317、ms?m/z(esi):583[m+1]

318、1h?nmr(400mhz,cd3od)δ8.44(s,1h),8.05(dd,j＝19.1,12.5hz,3h),7.86(dd,j＝7.6,4.8hz,2h),7.69–7.61(m,2h),7.54–7.47(m,2h),6.99(s,1h),4.78(d,j＝3.4hz,2h),3.91–3.79(m,2h),3.73–3.61(m,3h),3.41(dd,j＝16.2,4.6hz,4h),2.10–2.00(m,1h),1.98–1.85(m,2h),1.65–1.46(m,2h),0.99(d,j＝6.2hz,3h).

319、以下化合物參照實施例8的實驗步驟操作合成，但在操作中用不同的化合物代替四氫吡喃-4-醇。

320、

321、這些化合物的核磁數(shù)據(jù)如下：

322、

323、

324、實施例9

325、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((((1-羥基環(huán)丁基)甲基)(甲基)氨基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物19)

326、

327、第一步

328、4-((((1-羥基環(huán)丁基)甲基)氨基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(19a)

329、向7a(200mg，0.92mmol)的dmf(5ml)溶液中依次加入1-(氨基甲基)環(huán)丁烷-1-醇(140mg，1.38mmol)和k2co3(506mg，3.68mmol)，所得混合物加熱到70℃并攪拌2小時。冷卻至室溫后，過濾除去沉淀物，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至20/1)純化，得到目標產(chǎn)物19a(86mg，33％)。

330、ms?m/z(esi):283[m+1]

331、第二步

332、4-((((1-羥基環(huán)丁基)甲基)(甲基)氨基)甲基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(19b)

333、向19a(86mg，0.31mmol)和多聚甲醛(73mg，2.48mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中依次加入三乙胺(0.5ml)和三乙酰氧基硼氫化鈉(259mg，1.22mmol)。所得混合物加熱到30℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，用水(10ml)稀釋，然后用二氯甲烷(3×10ml)萃取。合并的有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至20/1)純化，得到目標產(chǎn)物19b(68mg，75％)。

334、ms?m/z(esi):297[m+1]

335、第三步

336、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((((1-羥基環(huán)丁基)甲基)(甲基)氨基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(19)

337、向19b(45mg，0.15mmol)、1g(51mg，0.15mmol)和甲苯(8ml)的混合物中依次加入pd2(dba)3(21mg，0.023mmol)、xantphos(27mg，0.046mmol)和碳酸銫(124mg，0.38mmol)。所得混合物在氮氣氣氛下加熱到110℃并攪拌11小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至30/1)純化，然后用prep-hplc再次純化得到目標產(chǎn)物19(8.5mg，9.4％)。

338、ms?m/z(esi):596[m+1]

339、1h?nmr(400mhz,dmso)δ8.56(s,1h),8.29–8.14(m,4h),7.93(d,j＝8.6hz,1h),7.88(d,j＝7.3hz,1h),7.77(d,j＝8.4hz,1h),7.67(d,j＝1.3hz,1h),7.64(t,j＝7.9hz,1h),7.05(s,1h),4.93(s,1h),3.90(s,2h),3.46(s,3h),2.54(s,2h),2.27(s,3h),2.17(ddd,j＝12.9,8.6,4.6hz,1h),2.03(dt,j＝8.9,4.9hz,2h),1.92(dd,j＝19.4,9.8hz,2h),1.66–1.56(m,1h),1.32(dd,j＝18.6,9.4hz,1h),1.10–1.02(m,2h),1.01–0.93(m,2h).

340、以下化合物參照實施例9的實驗步驟操作合成，但在操作中用不同的化合物代替1-(氨基甲基)環(huán)丁烷-1-醇。

341、

342、化合物的核磁數(shù)據(jù)如下：

343、

344、實施例10

345、(s)-2'-環(huán)丙基-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-6'-(4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)-[2,4'-聯(lián)吡啶]-5-腈(化合物24)和(s)-2'-環(huán)丙基-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-6'-(4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)-[2,4'-聯(lián)吡啶]-5-甲酰胺(化合物23)

346、

347、第一步

348、6-氨基-5-溴煙腈(23b)

349、向6-氨基煙腈23a(4.95g，41.6mmol)的乙腈(100ml)溶液中加入nbs(8.87g，49.9mmol)。室溫攪拌2小時后，混合物用水(200ml)稀釋，然后用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。合并的有機相用飽和食鹽水(100ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至19/1)純化，得到目標產(chǎn)物23b(8.23g，100％)。

350、ms?m/z(esi):198,200[m+1]

351、第二步

352、2-氨基-5-氰煙酸甲酯(23c)

353、向23b(3.75g，18.9mmol)的甲醇(50ml)溶液中加入三乙胺(5.75g，56.8mmol)和pd(dppf)cl2(693mg，0.95mmol)?；旌衔锓忾]在100-ml高壓釜中，然后在一氧化碳氣氛下(4個大氣壓)加熱至100℃并攪拌5小時。另一批23b(3.45g，17.4mmol)也按照上述操作進行反應(yīng)。冷卻到室溫后，將兩批反應(yīng)物混合，濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至19/1)純化，得到目標產(chǎn)物23c(5.64g，88％)。

354、ms?m/z(esi):178[m+1]

355、第三步

356、2-溴-5-氰煙酸甲酯(23d)

357、0℃下向亞硝酸叔丁酯(3.88g，37.6mmol)的thf(125ml)溶液中加入溴化銅(8.39g，37.6mmol)，然后將23c(4.44g，25mmol)的thf(125ml)溶液滴加到上述混合物中。所得混合物升溫至室溫并攪拌1.5小時，然后升溫到50℃并攪拌2小時。冷卻到室溫后，在減壓條件下濃縮至干。殘留物懸浮在二氯甲烷(200ml)和水(200ml)中，攪拌30分鐘，過濾。濾液靜置分層，分出有機相，水相用二氯甲烷(200ml)萃取。合并有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾后濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至4/1)純化，得到目標產(chǎn)物23d(2.54g，42％)。

358、ms?m/z(esi):241[m+1]

359、第四步

360、2',6'-二氯-5-氰基-[2,4'-聯(lián)吡啶]-3-羧酸(23e)

361、將23d(2.54g，10.5mmol)、(2,6-二氯吡啶-4-基)硼酸(2.02g，10.5mmol)、碳酸鉀(5.83g，42.2mmol)、pd(dppf)cl2(463mg，0.63mmol)、1,4-二氧六環(huán)(200ml)和水(4ml)的混合物加熱至100℃并攪拌20小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物經(jīng)硅藻土過濾。濾液用水(100ml)稀釋，然后用1n?hcl調(diào)節(jié)至ph＝3，然后用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。合并的有機相用飽和食鹽水(100ml)洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥。過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/乙酸乙酯＝100/0至3/2)純化，得到目標產(chǎn)物23e(1.04g，34％)。

362、ms?m/z(esi):294[m+1]

363、第五步

364、2',6'-二氯-3-(4-甲基-5-硫代-4,5-二氫-1h-1,2,4-三唑-3-基)-[2,4'-聯(lián)吡啶]-5-腈(23f)

365、向23e(1.04g，3.54mmol)和n-甲基肼碳硫酰胺(558mg，5.30mmol)的nmp(7ml)溶液中加入dipea(458mg，3.54mmol)和hatu(1.75g，4.60mmol)。室溫攪拌1小時后，往反應(yīng)混合物中加入khco3(3.5g，35.0mmol)和水(7ml)，然后加熱到100℃并攪拌9小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物過濾，濾餅用二氯甲烷(3×50ml)洗滌。合并后濾液的在減壓條件下濃縮至干，殘余物分散在二氯甲烷(200ml)中，再次過濾除去不溶物。新的濾液用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液直接用于下一步反應(yīng)。

366、第六步

367、2',6'-二氯-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-[2,4'-聯(lián)吡啶]-5-腈(24a)和2',6'-二氯-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-[2,4'-聯(lián)吡啶]-5-甲酰胺(23g)

368、將第五步中得到的23f的二氯甲烷(200ml)溶液冷卻到0℃，然后加入冰醋酸(5ml)和30％雙氧水(2ml)。室溫攪拌1小時后，在減壓條件下濃縮至干，殘余物用c18柱層析(乙腈/水＝5/95至3/7)純化，得到目標產(chǎn)物24a(244mg，21％)和23g(185mg，15％)。

369、24a，ms?m/z(esi):331[m+1]

370、23g，ms?m/z(esi):349[m+1]

371、第七步

372、2'-氯-6'-環(huán)丙基-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-[2,4'-聯(lián)吡啶]-5-腈(24b)

373、將24a(175mg，0.53mmol)、環(huán)丙基硼酸(91mg，1.06mmol)、碳酸鉀(293mg，2.12mmol)、pd(dppf)cl2(39mg，0.053mmol)、1,4-二氧六環(huán)(20ml)和水(0.5ml)混合在30ml微波管里，用氮氣置換體系中的空氣?；旌衔镌谖⒉ǚ磻?yīng)器里加熱至100℃并攪拌2小時。再次向混合物中加入環(huán)丙基硼酸(45mg，0.53mmol)和pd(dppf)cl2(39mg，0.053mmol)，再用微波反應(yīng)器加熱至100℃并攪拌2小時。冷卻到室溫后過濾，濾液在減壓條件下濃縮，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至9/1)純化，得到目標產(chǎn)物24b(60mg，34％)。

374、ms?m/z(esi):337[m+1]

375、第八步

376、(s)-2'-環(huán)丙基-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)-6'-(4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)-[2,4'-聯(lián)吡啶]-5-腈(24)

377、將24b(60mg，0.18mmol)、2a(50mg，0.18mmol)、碳酸銫(176mg，0.54mmol)、pd2(dba)3(18mg，0.02mmol)、xantphos(23mg，0.04mmol)和1,4-二氧六環(huán)(4ml)混合在10-ml微波管里，用氮氣置換體系中的空氣。混合物在微波反應(yīng)器里加熱至100℃并攪拌2小時。冷卻到室溫后，混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至9/1)純化，并再次用prep-hplc純化，得到目標產(chǎn)物24(47.8mg，46％)。

378、ms?m/z(esi):581[m+1]

379、1h?nmr(400mhz,cd3od)δ9.28(d,j＝2.0hz,1h),8.62(s,1h),8.57(d,j＝2.0hz,1h),8.14(d,j＝2.8hz,2h),7.97(d,j＝7.2hz,1h),7.86(d,j＝1.3hz,1h),7.70(d,j＝8.4hz,1h),7.61–7.56(m,1h),7.31(d,j＝1.3hz,1h),3.81(s,2h),3.52(s,3h),2.96–2.83(m,2h),2.21–2.15(m,1h),2.06–2.01(m,1h),1.71(ddd,j＝10.7,10.0,6.7hz,6h),1.11(d,j＝2.1hz,2h),1.09(s,2h),0.87(d,j＝6.0hz,3h).

380、化合物23可參照實施例10合成，但在第六步操作中用23g代替24a。

381、化合物23的表征數(shù)據(jù)如下：

382、ms?m/z(esi):599[m+1]

383、1h?nmr(400mhz,cd3od)δ9.39(d,j＝2.2hz,1h),8.60(s,1h),8.54(d,j＝2.2hz,1h),8.16(d,j＝2.3hz,2h),7.97(d,j＝7.2hz,1h),7.87(d,j＝1.3hz,1h),7.71(d,j＝8.4hz,1h),7.62–7.57(m,1h),7.32(d,j＝1.3hz,1h),3.90(s,2h),3.50(s,3h),3.02–2.87(m,2h),2.21–2.17(m,1h),2.03(dd,j＝12.2,6.5hz,1h),1.87–1.80(m,1h),1.78–1.68(m,4h),1.64(d,j＝12.9hz,1h),1.11(s,2h),1.09(s,2h),0.88(d,j＝6.3hz,3h).

384、實施例11

385、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-(1-((2-甲氧基乙基)氨基)乙基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物27)

386、

387、第一步

388、4-乙?；?2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-羧酸叔丁酯(27a)

389、將6a(100mg，0.28mmol)、pd(pph3)2cl2(25mg，0.028mmol)、三丁基(1-乙氧基乙烯)錫(200mg，0.56mmol)和1,4-二氧六環(huán)(4ml)的混合物加熱到100℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，混合物減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至9/1)純化，得到目標產(chǎn)物27a(20mg，34％)。

390、ms?m/z(esi):212[m+1-100]

391、第二步

392、4-乙?；讲cd]吲哚-2(1h)-酮(27b)

393、將27a(110mg，0.52mmol)溶解在氯化氫的乙醇溶液(5ml，2n)中，然后在室溫下攪拌2小時。混合物在減壓條件下濃縮至干，得到目標產(chǎn)物3a(100mg，96％)。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

394、ms?m/z(esi):212[m+1]

395、第三步

396、4-(1-羥乙基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(27c)

397、向27b(100mg，0.5mmol)的甲醇(2ml)溶液加入硼氫化鈉(46mg，1mmol)。所得混合物在室溫下攪拌3小時，然后在減壓條件下濃縮至干。殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至9/1)純化，得到目標產(chǎn)物27c(70mg，70％)。

398、ms?m/z(esi):214[m+1]

399、第四步

400、4-(1-氯乙基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(27d)

401、向27c(70mg，0.33mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入氯化亞砜(140mg，1.3mmol)。所得混合物在室溫下攪拌5小時，然后在減壓條件下濃縮至干，得到目標產(chǎn)物27d(70mg，粗品)。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

402、ms?m/z(esi):232[m+1]

403、第五步

404、4-(1-((2-甲氧基乙基)氨基)乙基)苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮(27e)

405、將27d(15mg，0.065mmol)、2-甲氧基乙胺(7mg，0.097mmol)、dipea(25mg，0.2mmol)和乙腈(1ml)的混合物加熱至90℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至0/100)純化，得到目標產(chǎn)物27e(20mg)。

406、ms?m/z(esi):271[m+1]

407、第六步

408、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-(1-((2-甲氧基乙基)氨基)乙基)-2-氧代苯并[cd]吲哚-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(27)

409、將27e(10mg，0.037mmol)、1g(20mg，0.073mmol)、pd2(dba)3(5mg，0.007mmol)、xantphos(9mg，0.014mmol)、碳酸鉀(15mg，0.11mmol)和1,4-二氧六環(huán)(2ml)的混合物加熱至90℃并攪拌12小時。冷卻至室溫后，混合物減壓條件下濃縮至干，殘余物用制備高效液相色譜純化得到目標產(chǎn)物27(4.9mg，23％)。

410、ms?m/z(esi):570[m+1]

411、1h?nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.55(s,1h),8.33–8.20(m,4h),7.96–7.91(m,1h),7.89(d,j＝7.2hz,1h),7.77(d,j＝8.3hz,1h),7.69–7.63(m,2h),7.06(d,j＝1.2hz,1h),3.46(s,3h),3.42–3.37(m,2h),3.29–3.26(m,2h),3.22(s,3h),2.23–2.14(m,1h),1.44(s,3h),1.26–1.20(m,1h),1.10–0.95(m,5h).

412、化合物28可參照實施例10合成，但在第五步操作中用(s)-3-甲基哌啶代替2-甲氧基乙胺。

413、化合物28的表征數(shù)據(jù)如下：

414、ms?m/z(esi):594[m+1]

415、1h?nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.56(s,1h),8.27–8.05(m,4h),7.97–7.91(m,1h),7.87(d,j＝7.1hz,1h),7.78(d,j＝8.4hz,1h),7.69–7.60(m,2h),7.05(s,1h),3.79(s,1h),3.48(s,3h),3.29(s,1h),3.01–2.81(m,2h),2.69(d,j＝15.7hz,1h),2.23–2.13(m,1h),1.98–1.79(m,1h),1.75–1.34(m,6h),1.31–1.17(m,1h),1.15–0.93(m,4h),0.92–0.67(m,4h).

416、實施例12

417、(s)-4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代吡咯并[4,3,2-de]喹啉-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物32)

418、

419、第一步

420、4-硝基吲哚啉-2-酮(32b)

421、向30-ml封管中加入4-硝基吲哚32a(2.4g，14.8mmol)、三溴化吡啶(5.68g，17.8mmol)、冰醋酸(10ml)和水(1ml)。所得混合物加熱到80℃并攪拌15小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/2)純化，得到目標產(chǎn)物32b(1.1g，41％)。

422、ms?m/z(esi):179[m+1]

423、第二步

424、2-(4-硝基-2-氧代吲哚啉-3-基)乙酸乙酯(32c)

425、0℃下向32b(1.1g，6.2mmol)的dmf(10ml)溶液中緩慢加入氫化鈉(60％，54.3mg，13.6mmol)。0℃下攪拌半小時后，緩慢加入溴乙酸乙酯(2.28g，13.6mmol)，然后在0℃下繼續(xù)攪拌兩小時。反應(yīng)混合物中加入飽和氯化銨溶液(50ml)，然后用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。合并的有機相用飽和氯化鈉溶液(50ml)洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥。過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝100/1至1/1)純化，得到目標產(chǎn)物32c(450mg，27％)。

426、ms?m/z(esi):265[m+1]

427、第三步

428、2-(4-氨基-2-氧代吲哚啉-3-基)乙酸乙酯(32d)

429、將32c(450mg，1.7mmol)、鈀碳(10％，200mg)和甲醇(30ml)的混合物在氫氣氣氛下攪拌15小時，然后過濾。濾液在減壓條件下濃縮至干，得到目標產(chǎn)物32d(400mg)。該產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

430、ms?m/z(esi):235[m+1]

431、第四步

432、2a,5-二氫吡咯并[4,3,2-de]喹啉-2,4(1h,3h)-二酮(32e)

433、將32d(400mg，粗品)、對甲苯磺酸一水合物(32mg，0.17mmol)、醋酸(1ml)和甲苯(10ml)混合，然后加熱到130℃并攪拌15小時。冷卻到室溫后，將反應(yīng)液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/15至1/1)純化，得到目標產(chǎn)物32e(140mg，43％)。

434、ms?m/z(esi):189[m+1]

435、第五步

436、吡咯并[4,3,2-de]喹啉-2,4(1h,5h)-二酮(32f)

437、向32e(140mg，0.74mmol)的甲苯(20ml)溶液中加入活性二氧化錳(323mg，3.72mmol)，然后所得混合物加熱到120℃并攪拌15小時。降溫到室溫后，反應(yīng)混合物用二氯甲烷/甲醇(30ml，10:1)稀釋，并攪拌10分鐘，然后過濾。濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝100/1至20/1)純化，得到目標產(chǎn)物32f(80mg，58％)。

438、ms?m/z(esi):187[m+1]

439、第六步

440、4-氯吡咯并[4,3,2-de]喹啉-2(1h)-酮(32g)

441、向32f(80mg，0.43mmol)的乙腈(10ml)溶液中加入三氯氧磷(1ml)。所得混合物加熱到85℃并攪拌2小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物溶解到二氯甲烷(50ml)中，然后用飽和碳酸氫鈉溶液(15ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾后，濾液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)純化，得到目標產(chǎn)物32g(50mg，57％)。

442、ms?m/z(esi):205[m+1]

443、第七步

444、4-(羥甲基)吡咯并[4,3,2-de]喹啉-2(1h)-酮(32h)

445、將32g(140mg，0.68mmol)、(三丁基甲錫烷基)甲醇(439mg，1.37mmol)、pd(dppf)cl2(95mg，0.14mmol)和1,4-二氧六環(huán)(5ml)的混合物加熱到110℃并攪拌2小時。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/2)純化，得到目標產(chǎn)物32h(60mg，44％)。

446、ms?m/z(esi):201[m+1]

447、第八步

448、4-(溴甲基)吡咯并[4,3,2-de]喹啉-2(1h)-酮(32i)

449、0℃下向32h(60mg，0.3mmol)和四溴化碳(120mg，0.36mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入三苯基膦(94mg，0.36mmol)，然后升溫到室溫并攪拌3小時。反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮至干，殘余物用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)純化，得到目標產(chǎn)物32i(35mg，44％)。

450、ms?m/z(esi):263,265[m+1]

451、第九步

452、(s)-4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)吡咯并[4,3,2-de]喹啉-2(1h)-酮(32j)將32i(15mg，0.057mmol)、dipea(29mg，0.23mmol)、(s)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(12mg，0.085mmol)和dma(2ml)混合，然后加熱至90℃并攪拌1小時。冷卻至室溫后，反應(yīng)混合物直接用prep-hplc純化，得到目標產(chǎn)物32j(10mg，62％)。

453、ms?m/z(esi):282[m+1]

454、第十步

455、(s)-5-((4-(4-氰基-2-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-6-環(huán)丙基吡啶-2-基)氨基)-2-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)喹啉-4-甲酸(32k)

456、將32j(10mg，0.035mmol)、1g(18mg，0.053mmol)、碳酸銫(23mg，0.07mmol)、xantphos(16mg，0.028mmol)和pd2(dba)3(13mg，0.014mmol)加入到甲苯(2ml)中，然后在氮氣氣氛下加熱至110℃并攪拌1.5小時。冷卻至室溫后，反應(yīng)混合物中加入冰醋酸(6mg)，然后在減壓條件下濃縮至干。殘余物用prep-hplc純化，得到目標產(chǎn)物32k(10mg，47％)。

457、ms?m/z(esi):599[m+1]

458、第十一步

459、(s)-4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2-氧代吡咯并[4,3,2-de]喹啉-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(32)

460、向32k(10mg，0.016mmol)的dmf(1ml)溶液中加入羰基二咪唑(27mg，0.16mmol)。所得混合物在室溫下攪拌3小時，然后直接用prep-hplc純化，得到目標產(chǎn)物32(2.4mg，26％)。

461、ms?m/z(esi):581.3[m+1]

462、1h?nmr(400mhz,cd3od)δ8.53(s,1h),8.14(t,j＝7.1hz,3h),7.97(dd,j＝12.8,7.0hz,2h),7.81(d,j＝5.8hz,2h),7.73(s,1h),7.14(s,1h),4.10(s,2h),3.49(d,j＝7.3hz,3h),2.98(d,j＝12.7hz,2h),2.28(s,1h),2.21–2.10(m,2h),2.05–1.96(m,2h),1.82–1.66(m,3h),1.59(d,j＝6.9hz,1h),1.10(d,j＝7.9hz,3h),0.93–0.87(m,3h).

463、實施例13

464、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((((1-羥基環(huán)丁基)甲基)氨基)甲基)-2-氧代吡咯并[4,3,2-de]喹啉-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(化合物33)

465、

466、第一步

467、4-((((1-羥基環(huán)丁基)甲基)氨基)甲基)吡咯并[4,3,2-去]喹啉-2(1h)-酮(33a)

468、將32i(30mg，0.11mmol)、dipea(43mg，0.33mmol)和1-(氨基甲基)環(huán)丁烷-1-醇(29mg，0.29mmol)加入到dma(2ml)中，所得混合物加熱至90℃并攪拌1小時。冷卻至室溫后，反應(yīng)混合物用prep-hplc純化，得到目標產(chǎn)物33a(30mg，96％)。

469、ms?m/z(esi):284[m+1]

470、第二步

471、4-(2-環(huán)丙基-6-(4-((((1-羥基環(huán)丁基)甲基)氨基)甲基)-2-氧代吡咯并[4,3,2-de]喹啉-1(2h)-基)吡啶-4-基)-3-(4-甲基-4h-1,2,4-三唑-3-基)苯甲腈(33)

472、將33a(25mg，0.088mmol)、1g(45mg，0.13mmol)、碳酸銫(57mg，0.176mmol)、xantphos(40mg，0.07mmol)和pd2(dba)3(32mg，0.035mmol)加入到甲苯(5ml)中，所得混合物在氮氣氣氛下加熱至110℃并攪拌1.5小時。冷卻至室溫后，反應(yīng)液在減壓條件下濃縮至干，殘余物用prep-hplc純化，得到目標產(chǎn)物33(1mg，2％)。

473、ms?m/z(esi):583[m+1]

474、1h?nmr(400mhz,cd3od)δ8.52(s,1h),8.18–8.11(m,2h),7.99(dd,j＝26.1,12.8hz,3h),7.85(s,2h),7.72(s,1h),7.15(s,1h),4.61(s,2h),3.48(s,3h),3.15(d,j＝16.8hz,2h),2.20(dd,j＝20.5,10.2hz,4h),2.03(d,j＝4.9hz,1h),1.80(d,j＝10.6hz,2h),1.63–1.56(m,1h),1.10(d,j＝8.4hz,3h).

475、生物學實驗

476、實施例14

477、人il-2驅(qū)動的報告基因表達活性的測試

478、jurkat?il-2-luc細胞是由人急性t細胞白血病細胞系jurkat，穩(wěn)定表達人il-2啟動子驅(qū)動的螢火蟲螢光素酶報告基因構(gòu)建而成，通過檢測螢火蟲熒光素酶的活性，可用于測試刺激條件下人il-2驅(qū)動的報告基因的轉(zhuǎn)錄激活。jurkat?il-2-luc細胞購自bpsbioscience公司(貨號為60481)。

479、將受試化合物在dmso(sigma，貨號為d5879)中溶解并稀釋至2.5mm，然后用dmso進行3倍系列稀釋至最低濃度為0.38μm，每個濃度點再使用rpmi1640培養(yǎng)基(thermofisher，貨號為11995073)稀釋62.5倍。如果化合物ec50值低，可降低化合物的起始濃度。

480、jurkat?il-2-luc細胞于37℃被培養(yǎng)在rpmi1640培養(yǎng)基中，外加10％fbs(excellbio，貨號為fsp500)和100units/ml青鏈霉素混合液(thermofisher，貨號為15140122)，然后被接種于含有30μlrpmi1640培養(yǎng)基的384孔板(thermofisher，貨號為164610)中(每孔含1×106個細胞/ml)。培養(yǎng)過夜后每孔加入5μl化合物溶液，30分鐘后再加入5μl抗體混合液[包含終濃度分別為10μg/ml的cd3抗體(thermofisher，貨號為16-0037-85)和5μg/ml的cd28抗體(thermofisher，貨號為16-0289-85)]。細胞于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)被培養(yǎng)6小時，然后按one-glo?luciferase試劑盒(promega，貨號為e6120)說明書操作，即將細胞培養(yǎng)板取出平衡至室溫，加20μl?one-glo試劑充分混勻，室溫放置10分鐘后用酶標儀(envision，perkin?elmer)讀取560nm發(fā)射波長的冷光信號。

481、該實驗中加cd3和cd28抗體混合液刺激作為刺激對照組，未加抗體混合液刺激作為本底對照組，使用xlfit軟件繪制化合物誘導il-2激活倍數(shù)增加曲線并計算相應(yīng)的ec50值，實驗結(jié)果見表1。

482、表1

483、

484、

485、本發(fā)明的實施例化合物對cbl-b的活性具有抑制效應(yīng)，優(yōu)選其ic50小于100nm。

技術(shù)實現(xiàn)思路