本發(fā)明屬于生物技術(shù)和微生物,涉及一株高產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂皮狀絲孢酵母突變株及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、生物柴油燃料性能與石油基柴油十分相似,能夠很好的代替石化能源。傳統(tǒng)的生物柴油主要是由動(dòng)植物油脂經(jīng)過催化脫羧或加氫裂化合成,但是動(dòng)植物油脂已經(jīng)無法滿足生物柴油供給需求。目前第三代生物柴油技術(shù)采用產(chǎn)油微生物生產(chǎn)生物柴油,成為了生物柴油產(chǎn)業(yè)的新希望。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源具來源廣泛、可再生等特點(diǎn),以木質(zhì)纖維素為原料進(jìn)行生物煉制生產(chǎn)微生物油脂具有良好的發(fā)展前景。
2、產(chǎn)油酵母是最優(yōu)的微生物油脂細(xì)胞工廠,但天然產(chǎn)油酵母受限于胞內(nèi)空間小、產(chǎn)油能力弱等因素,始終難以達(dá)到工業(yè)微生物油脂生產(chǎn)要求。目前已公開的專利中尚未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)和油脂產(chǎn)量均改變巨大的油脂酵母菌株。華南理工大學(xué)吳虹等(公開號(hào):cn101967452b)利用發(fā)酵性絲孢酵母經(jīng)過多輪紫外誘變和復(fù)合誘變,在木質(zhì)纖維素水解液的油脂產(chǎn)量?jī)H達(dá)到13.0g/l~20.4g/l。南京理工大學(xué)李晶等(公開號(hào):cn112522126a)在產(chǎn)油酵母紅酵母中敲除了三酰甘油脂肪酶aox2和atg15,在甘油為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中油脂產(chǎn)量?jī)H提高了2.1倍。華東理工大學(xué)鮑杰等(公開號(hào):cn?111690587?a)公開了一種利用長(zhǎng)周期的超速離心力獲得的高產(chǎn)油脂酵母,但是細(xì)胞體積和形態(tài)的改變不顯著。因此需要對(duì)產(chǎn)油酵母進(jìn)行進(jìn)一步的改造和進(jìn)化,以期獲得能夠利用木質(zhì)纖維素原料高效積累微生物油脂的工業(yè)生產(chǎn)菌株。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處,本發(fā)明的首要目的是提供一種能夠高產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂的菌株皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52,該菌株已經(jīng)由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為cctcc?m?20222050,保藏日期為2022年12月30日。本發(fā)明的另一目的是將該突變皮狀絲孢酵母菌株yy52成功應(yīng)用于以木質(zhì)纖維素為原料的微生物油脂生產(chǎn)中,以期達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
3、產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂皮狀絲孢酵母突變株,其獲得方法包括以下步驟:
4、(1)木質(zhì)纖維素水解液的制備;
5、(2)野生型皮狀絲孢酵母的活化培養(yǎng);
6、(3)野生型皮狀絲酵母在纖維素酶脅迫下的適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng);
7、(4)對(duì)進(jìn)化后獲得的高產(chǎn)油脂細(xì)胞進(jìn)行表型以及遺傳穩(wěn)定性分析;
8、(5)對(duì)進(jìn)化后獲得的突變菌株進(jìn)行突變位點(diǎn)的分析。
9、進(jìn)一步,在上述步驟(1)中,木質(zhì)纖維素水解液原料包括但不限于小麥秸稈、芒草、木屑等常見的木質(zhì)纖維素生物質(zhì);水解液固體含量為5-35%(w/w),其中葡萄糖濃度為10-160g/l,木糖濃度為5-50g/l。
10、進(jìn)一步,在其步驟(3)中,纖維素酶脅迫的適應(yīng)性進(jìn)化在水解液中進(jìn)行,將纖維素酶cellic?ctec?2.0按照1-4mg蛋白/g干物質(zhì)的濃度添加在水解液中,并接入皮狀絲孢酵母細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后進(jìn)行超速離心,離心后取上層細(xì)胞作為種子進(jìn)行下一代的培養(yǎng),在連續(xù)培養(yǎng)中記錄細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)油脂含量。
11、進(jìn)一步,在其步驟(4)中,最終進(jìn)化所得皮狀絲孢酵母菌株命名為t.cutaneumyy52,已于2022年12月30日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為cctcc?m20222050。
12、進(jìn)一步,在其步驟(4)中,表型分析表明t.cutaneum?yy52菌株,相比于野生型皮狀絲孢酵母菌株,細(xì)胞體積增大兩個(gè)數(shù)量級(jí)、細(xì)胞壁顯著變薄。
13、進(jìn)一步,在其步驟(4)中,遺傳穩(wěn)定性分析表明t.cutaneum?yy52菌株在水解液環(huán)境以及ypd培養(yǎng)基中的多次傳代仍能保持穩(wěn)定的性狀遺傳。
14、進(jìn)一步,在其步驟(5)中,相比于出發(fā)菌株t.cutaneum?accc?20271,yy52菌株基因組發(fā)生了多達(dá)2386個(gè)突變位點(diǎn),其中189個(gè)突變發(fā)生在外顯子編碼區(qū)。因此在生物學(xué)意義上yy52屬于一株具有遺傳穩(wěn)定性的全新的皮狀絲孢酵母菌株。
15、進(jìn)一步,以上述所得t.cutaneum?yy52菌株為發(fā)酵菌株,進(jìn)一步評(píng)價(jià)其木質(zhì)纖維素基微生物油脂的生產(chǎn)潛力,包括如下步驟:
16、(1)對(duì)木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理,脫毒
17、(2)同步糖化共發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂
18、(3)胞內(nèi)微生物油脂的提取和純化;
19、(4)纖維素油脂脂肪酸組成的鑒定。
20、本發(fā)明還提供一株高產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂皮狀絲孢酵母突變株的應(yīng)用,在其步驟(2)中,將脫毒后的木質(zhì)纖維素原料和纖維素酶和加入反應(yīng)器,加入營(yíng)養(yǎng)鹽,在50℃,ph4.8的條件下預(yù)酶解0-24小時(shí);然后在30℃,ph5.0的條件下接入突變皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂。木質(zhì)纖維素原料包括但不限于小麥秸稈、芒草、木屑等常見的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵固體含量為5-35%(w/w)。所用纖維素酶為常規(guī)商業(yè)纖維素酶。
21、進(jìn)一步,在其步驟(3)和(4)中,微生物油脂的提取的方法采用熱酸法,進(jìn)一步采用有機(jī)溶劑萃取油脂;采用氣相色譜對(duì)胞內(nèi)油脂脂肪酸組成進(jìn)行測(cè)定
22、進(jìn)一步,在其步驟(5)中,利用全基因組重測(cè)序以出發(fā)菌株為對(duì)照菌株,檢測(cè)進(jìn)化所獲得最終皮狀絲孢酵母yy52菌株的單核苷酸多態(tài)性(snp)、插入和缺失(indel)、拷貝數(shù)變異(cnv)類型的突變。
23、發(fā)明詳述:
24、一種發(fā)酵性絲孢酵母菌株t.cutaneum?yy52,該菌株是以野生型皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc?20271(購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心)為出發(fā)菌株經(jīng)過長(zhǎng)周期的纖維素酶脅迫適應(yīng)性進(jìn)化而來的。
25、所述的纖維素酶脅迫適應(yīng)性進(jìn)化是:
26、(1)制備5-32%(w/w)固含量的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解液。
27、(2)菌種活化:將在20-25%(v/v)甘油保存的皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc20271劃線于ypd平板上,28~37℃恒溫培養(yǎng)3~4天,挑取單菌落轉(zhuǎn)接入液體ypd中培養(yǎng)1~2天,以10%(v/v)接種量作為適應(yīng)性進(jìn)化的種子。
28、(3)以基本維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)為原則,在皮狀絲孢酵母的培養(yǎng)基中加入3.4mg蛋白/ml常規(guī)商業(yè)纖維素酶,每代均在在30℃和180rpm條件下培養(yǎng)96-120小時(shí)。在每次轉(zhuǎn)接時(shí)取10-20ml發(fā)酵液離心并加入等體積的玉米油混合后離心,離心轉(zhuǎn)速每2-3代逐步升提高至最高(45,000g),離心后取上層油相中的細(xì)胞,以10%(v/v)接種量接入下一代的培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞的形態(tài)和油脂含量。直到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生巨大變化、胞內(nèi)油脂積累顯著提高。對(duì)進(jìn)化獲得的菌株進(jìn)行分離純化,將該菌株命名為t.cutaneum?yy52。
29、為了進(jìn)一步確認(rèn)是否得到一株性狀穩(wěn)定的目標(biāo)突變株,對(duì)皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性和突變位點(diǎn)的分析。遺傳穩(wěn)定性分析分別在木質(zhì)纖維素水解液和非油脂積累的ypd培養(yǎng)基中進(jìn)行數(shù)次傳代,觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)油脂含量。最終得到性狀穩(wěn)定、與進(jìn)化終點(diǎn)性狀一致、形態(tài)呈巨大的紡錘形、脂質(zhì)小體充滿整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部的目標(biāo)菌株。進(jìn)化所獲得的細(xì)胞細(xì)胞壁中葡聚糖含量顯著降低91.7%,甘露聚糖含量減少將近50%,細(xì)胞壁薄且脆弱,容易發(fā)生自發(fā)裂解。其在木質(zhì)纖維素水解液中油脂含量高達(dá)72%以上。利用全基因組重測(cè)序,以出發(fā)菌株皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc?20271為對(duì)照利用第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation?sequencing,ngs),基于novaseq測(cè)序平臺(tái),檢測(cè)進(jìn)化菌株t.cutaneum?yy52的基因突變情況,以出發(fā)菌株皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc?202171為對(duì)照,t.cutaneum?yy52共發(fā)生snp(單核苷酸多態(tài)性)1443個(gè)、indel(小的插入和缺失)938個(gè),cnv(拷貝數(shù)變異)5個(gè),發(fā)生在外顯子編碼區(qū)的突變位點(diǎn)共計(jì)189個(gè)。
30、皮狀絲孢酵母利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)微生物油脂的應(yīng)用,步驟如下:
31、(1)原料的預(yù)處理和脫毒。原料包括但不限于玉米秸稈、小麥秸稈、稻桿、油菜桿、稻草、軟木、硬木等農(nóng)業(yè)廢棄物中的一種或幾種,預(yù)處理?xiàng)l件為固液比1:10~2:1,溫度100~200℃,壓力0.5~1.5mpa,酸溶液濃度2~15%,預(yù)處理時(shí)間3~20min。
32、(2)將脫毒后的木質(zhì)纖維素原料和纖維素酶加入反應(yīng)器,加入營(yíng)養(yǎng)鹽,在50℃,ph5.0的條件下預(yù)糖化0-24小時(shí);然后在30℃,ph5.0的條件下接入突變菌株,進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂。
33、(3)微生物油脂的提取與純化。微生物油脂的提取方法包括索氏抽提法,熱酸法,比重法,超聲波提取法等。作為優(yōu)選本專利選擇熱酸法提取微生物油脂,并進(jìn)一步采用有機(jī)溶劑萃取油脂的方法。
34、所述的熱酸法提取微生物油脂,包括酸解細(xì)胞,醇-有機(jī)溶劑萃取,離心,減壓蒸發(fā)、烘干稱重。
35、(4)突變產(chǎn)油菌株的油脂脂肪酸組成的鑒定。
36、所述脂肪酸組成鑒定方法為氣相色譜法,具體操作包括:利用2%-7%甲醇將細(xì)胞甲酯化后,使用氣相色譜進(jìn)行脂肪酸組成檢測(cè),操作條件為:進(jìn)樣溫度230℃-280℃,氮?dú)?-5ml/min,溫度梯度10-20℃/min,從80℃持續(xù)3-5min至280℃,保持5-10min。
37、本發(fā)明對(duì)野生型皮狀絲孢酵母菌株trichosporon?cutaneum?accc?20271(購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心)在木質(zhì)纖維素水解液中進(jìn)行長(zhǎng)周期的纖維素酶脅迫下的適應(yīng)性進(jìn)化,對(duì)進(jìn)化終點(diǎn)的細(xì)胞群進(jìn)行單菌落分離并檢驗(yàn)其性狀的遺傳穩(wěn)定性。最終得到的一株高產(chǎn)微生物油脂菌株,并命名為t.cutaneum?yy52。全基因組重測(cè)序表明,t.cutaneumyy52相比于野生型菌株發(fā)生了多達(dá)2386個(gè)位點(diǎn)的突變,其中189個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生在外顯子編碼區(qū)。因此在生物學(xué)意義上t.cutaneum?yy52屬于一株具有遺傳穩(wěn)定性的全新的皮狀絲孢酵母菌株。相比于野生型皮狀絲孢酵母菌株,t.cutaneum?yy52細(xì)胞體積增大兩個(gè)數(shù)量級(jí)、細(xì)胞壁顯著變薄、細(xì)胞壁多聚糖組分發(fā)生顯著變化、胞內(nèi)油脂含量達(dá)到72.5%(相比于出發(fā)菌株提高了2.7倍)。t.cutaneum?yy52已于2022年12月30日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為cctcc?m?20222050。突變菌株t.cutaneum?yy52利用高固含量的小麥秸稈和玉米秸稈原料通過同步糖化共發(fā)酵的方式發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂,油脂的最高產(chǎn)量分別為55.4g/l和58.4g/l,均為目前國(guó)內(nèi)外纖維素原料生產(chǎn)微生物油脂的最高水平,具有生產(chǎn)微生物油脂良好的應(yīng)用前景。
38、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下積極效果:
39、(1)與出發(fā)菌株相比,皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞壁發(fā)生顯著變化,出發(fā)菌株呈小的橢球型,皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52呈巨大的橢球形、細(xì)胞體積比出發(fā)菌株增大兩個(gè)數(shù)量級(jí)、脂質(zhì)小體充滿整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部。皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52細(xì)胞壁顯著變薄、細(xì)胞壁組分中葡聚糖組分和甘露聚糖組分分別顯著降低90%和40%以上。
40、(2)利用固含量30%(w/w)小麥秸稈和玉米秸稈原料生產(chǎn)微生物油脂,皮狀絲孢酵母yy52的油脂產(chǎn)量分別達(dá)到55.4±0.5g/l和58.4±0.1g/l,是目前文獻(xiàn)記錄的纖維素微生物油脂的最高水平。與其原始菌株accc?20271相比,分別提高了7.2和5.7倍,能夠更高效地積累油脂。
41、本發(fā)明皮狀絲孢酵母菌株命名為t.cutaneum?yy52,已于2022年12月30日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為cctcc?m?20222050。