本發(fā)明屬于生物技術(shù)和微生物，涉及一株高產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂皮狀絲孢酵母突變株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、生物柴油燃料性能與石油基柴油十分相似，能夠很好的代替石化能源。傳統(tǒng)的生物柴油主要是由動(dòng)植物油脂經(jīng)過催化脫羧或加氫裂化合成，但是動(dòng)植物油脂已經(jīng)無法滿足生物柴油供給需求。目前第三代生物柴油技術(shù)采用產(chǎn)油微生物生產(chǎn)生物柴油,成為了生物柴油產(chǎn)業(yè)的新希望。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源具來源廣泛、可再生等特點(diǎn)，以木質(zhì)纖維素為原料進(jìn)行生物煉制生產(chǎn)微生物油脂具有良好的發(fā)展前景。

2、產(chǎn)油酵母是最優(yōu)的微生物油脂細(xì)胞工廠，但天然產(chǎn)油酵母受限于胞內(nèi)空間小、產(chǎn)油能力弱等因素，始終難以達(dá)到工業(yè)微生物油脂生產(chǎn)要求。目前已公開的專利中尚未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)和油脂產(chǎn)量均改變巨大的油脂酵母菌株。華南理工大學(xué)吳虹等(公開號(hào)：cn101967452b)利用發(fā)酵性絲孢酵母經(jīng)過多輪紫外誘變和復(fù)合誘變，在木質(zhì)纖維素水解液的油脂產(chǎn)量?jī)H達(dá)到13.0g/l～20.4g/l。南京理工大學(xué)李晶等(公開號(hào)：cn112522126a)在產(chǎn)油酵母紅酵母中敲除了三酰甘油脂肪酶aox2和atg15，在甘油為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中油脂產(chǎn)量?jī)H提高了2.1倍。華東理工大學(xué)鮑杰等(公開號(hào)：cn?111690587?a)公開了一種利用長(zhǎng)周期的超速離心力獲得的高產(chǎn)油脂酵母，但是細(xì)胞體積和形態(tài)的改變不顯著。因此需要對(duì)產(chǎn)油酵母進(jìn)行進(jìn)一步的改造和進(jìn)化，以期獲得能夠利用木質(zhì)纖維素原料高效積累微生物油脂的工業(yè)生產(chǎn)菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的是提供一種能夠高產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂的菌株皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52，該菌株已經(jīng)由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為cctcc?m?20222050，保藏日期為2022年12月30日。本發(fā)明的另一目的是將該突變皮狀絲孢酵母菌株yy52成功應(yīng)用于以木質(zhì)纖維素為原料的微生物油脂生產(chǎn)中，以期達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

3、產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂皮狀絲孢酵母突變株，其獲得方法包括以下步驟：

4、(1)木質(zhì)纖維素水解液的制備；

5、(2)野生型皮狀絲孢酵母的活化培養(yǎng)；

6、(3)野生型皮狀絲酵母在纖維素酶脅迫下的適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng)；

7、(4)對(duì)進(jìn)化后獲得的高產(chǎn)油脂細(xì)胞進(jìn)行表型以及遺傳穩(wěn)定性分析；

8、(5)對(duì)進(jìn)化后獲得的突變菌株進(jìn)行突變位點(diǎn)的分析。

9、進(jìn)一步，在上述步驟(1)中，木質(zhì)纖維素水解液原料包括但不限于小麥秸稈、芒草、木屑等常見的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)；水解液固體含量為5-35％(w/w),其中葡萄糖濃度為10-160g/l，木糖濃度為5-50g/l。

10、進(jìn)一步，在其步驟(3)中，纖維素酶脅迫的適應(yīng)性進(jìn)化在水解液中進(jìn)行，將纖維素酶cellic?ctec?2.0按照1-4mg蛋白/g干物質(zhì)的濃度添加在水解液中，并接入皮狀絲孢酵母細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后進(jìn)行超速離心，離心后取上層細(xì)胞作為種子進(jìn)行下一代的培養(yǎng)，在連續(xù)培養(yǎng)中記錄細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)油脂含量。

11、進(jìn)一步，在其步驟(4)中，最終進(jìn)化所得皮狀絲孢酵母菌株命名為t.cutaneumyy52，已于2022年12月30日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?m20222050。

12、進(jìn)一步，在其步驟(4)中，表型分析表明t.cutaneum?yy52菌株，相比于野生型皮狀絲孢酵母菌株，細(xì)胞體積增大兩個(gè)數(shù)量級(jí)、細(xì)胞壁顯著變薄。

13、進(jìn)一步，在其步驟(4)中，遺傳穩(wěn)定性分析表明t.cutaneum?yy52菌株在水解液環(huán)境以及ypd培養(yǎng)基中的多次傳代仍能保持穩(wěn)定的性狀遺傳。

14、進(jìn)一步，在其步驟(5)中，相比于出發(fā)菌株t.cutaneum?accc?20271，yy52菌株基因組發(fā)生了多達(dá)2386個(gè)突變位點(diǎn)，其中189個(gè)突變發(fā)生在外顯子編碼區(qū)。因此在生物學(xué)意義上yy52屬于一株具有遺傳穩(wěn)定性的全新的皮狀絲孢酵母菌株。

15、進(jìn)一步，以上述所得t.cutaneum?yy52菌株為發(fā)酵菌株，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其木質(zhì)纖維素基微生物油脂的生產(chǎn)潛力，包括如下步驟：

16、(1)對(duì)木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，脫毒

17、(2)同步糖化共發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂

18、(3)胞內(nèi)微生物油脂的提取和純化；

19、(4)纖維素油脂脂肪酸組成的鑒定。

20、本發(fā)明還提供一株高產(chǎn)木質(zhì)纖維素基微生物油脂皮狀絲孢酵母突變株的應(yīng)用，在其步驟(2)中，將脫毒后的木質(zhì)纖維素原料和纖維素酶和加入反應(yīng)器，加入營(yíng)養(yǎng)鹽，在50℃，ph4.8的條件下預(yù)酶解0-24小時(shí)；然后在30℃，ph5.0的條件下接入突變皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂。木質(zhì)纖維素原料包括但不限于小麥秸稈、芒草、木屑等常見的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵固體含量為5-35％(w/w)。所用纖維素酶為常規(guī)商業(yè)纖維素酶。

21、進(jìn)一步，在其步驟(3)和(4)中，微生物油脂的提取的方法采用熱酸法，進(jìn)一步采用有機(jī)溶劑萃取油脂；采用氣相色譜對(duì)胞內(nèi)油脂脂肪酸組成進(jìn)行測(cè)定

22、進(jìn)一步，在其步驟(5)中，利用全基因組重測(cè)序以出發(fā)菌株為對(duì)照菌株，檢測(cè)進(jìn)化所獲得最終皮狀絲孢酵母yy52菌株的單核苷酸多態(tài)性(snp)、插入和缺失(indel)、拷貝數(shù)變異(cnv)類型的突變。

23、發(fā)明詳述：

24、一種發(fā)酵性絲孢酵母菌株t.cutaneum?yy52，該菌株是以野生型皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc?20271(購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心)為出發(fā)菌株經(jīng)過長(zhǎng)周期的纖維素酶脅迫適應(yīng)性進(jìn)化而來的。

25、所述的纖維素酶脅迫適應(yīng)性進(jìn)化是：

26、(1)制備5-32％(w/w)固含量的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解液。

27、(2)菌種活化：將在20-25％(v/v)甘油保存的皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc20271劃線于ypd平板上，28～37℃恒溫培養(yǎng)3～4天，挑取單菌落轉(zhuǎn)接入液體ypd中培養(yǎng)1～2天，以10％(v/v)接種量作為適應(yīng)性進(jìn)化的種子。

28、(3)以基本維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)為原則，在皮狀絲孢酵母的培養(yǎng)基中加入3.4mg蛋白/ml常規(guī)商業(yè)纖維素酶，每代均在在30℃和180rpm條件下培養(yǎng)96-120小時(shí)。在每次轉(zhuǎn)接時(shí)取10-20ml發(fā)酵液離心并加入等體積的玉米油混合后離心，離心轉(zhuǎn)速每2-3代逐步升提高至最高(45,000g)，離心后取上層油相中的細(xì)胞，以10％(v/v)接種量接入下一代的培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞的形態(tài)和油脂含量。直到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生巨大變化、胞內(nèi)油脂積累顯著提高。對(duì)進(jìn)化獲得的菌株進(jìn)行分離純化，將該菌株命名為t.cutaneum?yy52。

29、為了進(jìn)一步確認(rèn)是否得到一株性狀穩(wěn)定的目標(biāo)突變株，對(duì)皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性和突變位點(diǎn)的分析。遺傳穩(wěn)定性分析分別在木質(zhì)纖維素水解液和非油脂積累的ypd培養(yǎng)基中進(jìn)行數(shù)次傳代，觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)油脂含量。最終得到性狀穩(wěn)定、與進(jìn)化終點(diǎn)性狀一致、形態(tài)呈巨大的紡錘形、脂質(zhì)小體充滿整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部的目標(biāo)菌株。進(jìn)化所獲得的細(xì)胞細(xì)胞壁中葡聚糖含量顯著降低91.7％，甘露聚糖含量減少將近50％，細(xì)胞壁薄且脆弱，容易發(fā)生自發(fā)裂解。其在木質(zhì)纖維素水解液中油脂含量高達(dá)72％以上。利用全基因組重測(cè)序，以出發(fā)菌株皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc?20271為對(duì)照利用第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation?sequencing，ngs)，基于novaseq測(cè)序平臺(tái)，檢測(cè)進(jìn)化菌株t.cutaneum?yy52的基因突變情況，以出發(fā)菌株皮狀絲孢酵母t.cutaneum?accc?202171為對(duì)照，t.cutaneum?yy52共發(fā)生snp(單核苷酸多態(tài)性)1443個(gè)、indel(小的插入和缺失)938個(gè)，cnv(拷貝數(shù)變異)5個(gè)，發(fā)生在外顯子編碼區(qū)的突變位點(diǎn)共計(jì)189個(gè)。

30、皮狀絲孢酵母利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)微生物油脂的應(yīng)用，步驟如下：

31、(1)原料的預(yù)處理和脫毒。原料包括但不限于玉米秸稈、小麥秸稈、稻桿、油菜桿、稻草、軟木、硬木等農(nóng)業(yè)廢棄物中的一種或幾種，預(yù)處理?xiàng)l件為固液比1:10～2:1，溫度100～200℃，壓力0.5～1.5mpa，酸溶液濃度2～15％，預(yù)處理時(shí)間3～20min。

32、(2)將脫毒后的木質(zhì)纖維素原料和纖維素酶加入反應(yīng)器，加入營(yíng)養(yǎng)鹽，在50℃，ph5.0的條件下預(yù)糖化0-24小時(shí)；然后在30℃，ph5.0的條件下接入突變菌株，進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂。

33、(3)微生物油脂的提取與純化。微生物油脂的提取方法包括索氏抽提法，熱酸法，比重法，超聲波提取法等。作為優(yōu)選本專利選擇熱酸法提取微生物油脂，并進(jìn)一步采用有機(jī)溶劑萃取油脂的方法。

34、所述的熱酸法提取微生物油脂，包括酸解細(xì)胞，醇-有機(jī)溶劑萃取，離心，減壓蒸發(fā)、烘干稱重。

35、(4)突變產(chǎn)油菌株的油脂脂肪酸組成的鑒定。

36、所述脂肪酸組成鑒定方法為氣相色譜法，具體操作包括：利用2％-7％甲醇將細(xì)胞甲酯化后，使用氣相色譜進(jìn)行脂肪酸組成檢測(cè)，操作條件為：進(jìn)樣溫度230℃-280℃，氮?dú)?-5ml/min，溫度梯度10-20℃/min，從80℃持續(xù)3-5min至280℃，保持5-10min。

37、本發(fā)明對(duì)野生型皮狀絲孢酵母菌株trichosporon?cutaneum?accc?20271(購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心)在木質(zhì)纖維素水解液中進(jìn)行長(zhǎng)周期的纖維素酶脅迫下的適應(yīng)性進(jìn)化，對(duì)進(jìn)化終點(diǎn)的細(xì)胞群進(jìn)行單菌落分離并檢驗(yàn)其性狀的遺傳穩(wěn)定性。最終得到的一株高產(chǎn)微生物油脂菌株，并命名為t.cutaneum?yy52。全基因組重測(cè)序表明，t.cutaneumyy52相比于野生型菌株發(fā)生了多達(dá)2386個(gè)位點(diǎn)的突變，其中189個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生在外顯子編碼區(qū)。因此在生物學(xué)意義上t.cutaneum?yy52屬于一株具有遺傳穩(wěn)定性的全新的皮狀絲孢酵母菌株。相比于野生型皮狀絲孢酵母菌株，t.cutaneum?yy52細(xì)胞體積增大兩個(gè)數(shù)量級(jí)、細(xì)胞壁顯著變薄、細(xì)胞壁多聚糖組分發(fā)生顯著變化、胞內(nèi)油脂含量達(dá)到72.5％(相比于出發(fā)菌株提高了2.7倍)。t.cutaneum?yy52已于2022年12月30日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?m?20222050。突變菌株t.cutaneum?yy52利用高固含量的小麥秸稈和玉米秸稈原料通過同步糖化共發(fā)酵的方式發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂，油脂的最高產(chǎn)量分別為55.4g/l和58.4g/l，均為目前國(guó)內(nèi)外纖維素原料生產(chǎn)微生物油脂的最高水平，具有生產(chǎn)微生物油脂良好的應(yīng)用前景。

38、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下積極效果：

39、(1)與出發(fā)菌株相比，皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞壁發(fā)生顯著變化，出發(fā)菌株呈小的橢球型，皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52呈巨大的橢球形、細(xì)胞體積比出發(fā)菌株增大兩個(gè)數(shù)量級(jí)、脂質(zhì)小體充滿整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部。皮狀絲孢酵母t.cutaneum?yy52細(xì)胞壁顯著變薄、細(xì)胞壁組分中葡聚糖組分和甘露聚糖組分分別顯著降低90％和40％以上。

40、(2)利用固含量30％(w/w)小麥秸稈和玉米秸稈原料生產(chǎn)微生物油脂，皮狀絲孢酵母yy52的油脂產(chǎn)量分別達(dá)到55.4±0.5g/l和58.4±0.1g/l，是目前文獻(xiàn)記錄的纖維素微生物油脂的最高水平。與其原始菌株accc?20271相比，分別提高了7.2和5.7倍，能夠更高效地積累油脂。

41、本發(fā)明皮狀絲孢酵母菌株命名為t.cutaneum?yy52，已于2022年12月30日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?m?20222050。