本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)。更具體地，涉及一種用于同時(shí)檢測(cè)13種食源性致病菌的可視化試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、食源性疾病是指通過攝食而進(jìn)入人體的有毒有害物質(zhì)(包括生物性病原體)等致病因子所造成的疾病。包括常見的食物中毒、腸道傳染病、寄生蟲病等。食源性疾病的發(fā)病率居各類疾病總發(fā)病率的前列，是當(dāng)前世界上最突出的衛(wèi)生問題。而食源性致病菌是引起食源性疾病的重要因素。常見的食源性致病菌包括耶爾森氏菌、惡臭假單胞菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌、腸道沙門氏菌、霍亂弧菌、福氏志賀氏菌、阪崎克洛諾桿菌、大腸桿菌、溶血性鏈球菌、副溶血弧菌、單細(xì)胞增生李斯特菌與創(chuàng)傷弧菌等。這些致病菌通過攝食進(jìn)入人體后，造成細(xì)菌性食源性疾病，引起一系列嚴(yán)重疾病，對(duì)人體安全產(chǎn)生極大的威脅。因此準(zhǔn)確檢測(cè)食源性致病菌是保障當(dāng)今食品安全的關(guān)鍵之一。

2、目前，常規(guī)檢測(cè)致病菌所使用的生理生化、血清型水平的方法操作比較繁瑣對(duì)操作人員技術(shù)水平要求比較高且檢測(cè)的周期長。如對(duì)食源性致病菌進(jìn)行的常規(guī)生化鑒定，即在瓊脂平板上培養(yǎng)微生物，然后進(jìn)行鑒定，這項(xiàng)技術(shù)成本低，能直接鑒定微生物，但一般需要較長時(shí)間；此外，細(xì)菌有活力但不可培養(yǎng)狀態(tài)(vbnc)的存在會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

3、隨著生物技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)、生化鑒定、免疫反應(yīng)和生物傳感器等技術(shù)的發(fā)展，也逐漸應(yīng)用于致病菌的實(shí)際檢測(cè)當(dāng)中。雖然利用這些檢測(cè)技術(shù)效果好、檢測(cè)所需時(shí)間更短。但基于聚合酶鏈反應(yīng)pcr原理的食源性致病菌鑒定方法仍然存在以下幾個(gè)難題：1)檢測(cè)存在較大的假陽性風(fēng)險(xiǎn)，且不能直接反應(yīng)出檢測(cè)結(jié)果；2)復(fù)雜的實(shí)際樣品會(huì)很大程度影響采樣、制備和分析的結(jié)果；3)普通pcr無法實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，而多重pcr又會(huì)存在多種限制如二聚體的產(chǎn)生和產(chǎn)物長度相近干擾觀察等。如現(xiàn)有技術(shù)公開的運(yùn)用多重pcr方法結(jié)合基因芯片技術(shù)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)11種常見致病菌的方法。雖然該方法提高了檢測(cè)通量，但該方法還是檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)假陽性、有復(fù)雜基質(zhì)干擾、特異性不高等情況；同時(shí)，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)或方法并不能同時(shí)檢測(cè)更多病原菌，也未能區(qū)分種屬關(guān)系較親的細(xì)菌，即在復(fù)雜的環(huán)境條件下不能精準(zhǔn)識(shí)別靶標(biāo)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

4、因此，目前常規(guī)的pcr檢測(cè)技術(shù)很難滿足常規(guī)食品抽檢或應(yīng)對(duì)突發(fā)和重大食品安全事故中大規(guī)模快速的食源性致病菌檢測(cè)的需要，為了克服pcr對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物尺寸依賴與凝膠電泳對(duì)微生物鑒定不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，避免多重pcr存在多種限制的產(chǎn)生和產(chǎn)物之間相近的干擾情況發(fā)生，需要更進(jìn)一步提升檢測(cè)的特異性，避免種屬關(guān)系較親的細(xì)菌的檢測(cè)不準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)對(duì)更多不同靶標(biāo)菌的定性分析，而建立一種新的能夠同時(shí)檢測(cè)更多種食源性致病菌的方法具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述問題的缺陷和不足，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)13種食源性致病菌的可視化試劑盒及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明再一目的是提供所述可視化試劑盒的應(yīng)用。

3、本發(fā)明又一目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)13種食源性致病菌的方法。

4、本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

5、本發(fā)明提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)13種食源性致病菌的可視化試劑盒，包括同時(shí)檢測(cè)13種食源性致病菌的dna芯片和檢測(cè)13種食源性致病菌的多重不對(duì)稱pcr引物；所述dna芯片包括固相載體和固定在固相載體上的寡聚核苷酸探針，所述寡聚核苷酸探針為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersinia?enterocolitica)、惡臭假單胞菌(pseudomonas?putida)、擬態(tài)弧菌(vibrio?mimicus)、溶藻弧菌(vibrio?alginolyticus)、腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)、霍亂弧菌(vibrio?cholerae)、福氏志賀氏菌(shigella?flexneri)、阪崎克羅諾桿菌(cronobacter?sakazakii)、腸出血性大腸桿菌(escherichia?coli(ehec))、溶血性鏈球菌(streptococcus?pyogenes)、副溶血性弧菌(vibrio?parahaemolyticus)、單細(xì)胞增生李斯特菌(listeria?monocytogenes)和創(chuàng)傷弧菌(vibrio?vulnificus)的探針；

6、具體探針序列為：

7、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌-p：5’-tgtgtacgctgcgagtg-3’；

8、惡臭假單胞菌-p：5’-tttttttttttttttgtcgggtggctg-3’；

9、擬態(tài)弧菌-p：5’-ttttttttttgtgaaccaaagttggga-3’；

10、溶藻弧菌-p：5’-ttttttttttcaaattggttgat-3’；

11、腸道沙門氏菌-p：5’-gggtcgttctacattgacagaat-3’；

12、霍亂弧菌-p：5’-ttttttttttctgccaactcactttgag-3’；

13、福氏志賀氏菌-p：5’-ttttttttttttttggtttcctctgagt-3’；

14、阪崎克洛諾桿菌-p：5’-tttttttttttttttttttttttttttttgggccgctgatac-3’；

15、腸出血性大腸桿菌-p：5’-gctaatccttggcct-3’；

16、溶血性鏈球菌-p：5’-acgcactaaacccttcagctc-3’；

17、副溶血弧菌-p：5’-ggttggttgtactggggcag-3’；

18、單細(xì)胞增生李斯特菌-p：5’-agatcatttagataacgactagcgt-3’；

19、創(chuàng)傷弧菌-p：5’-tgcgaacttagcacagatgcgaacttagcacaga-3’。

20、所述多重不對(duì)稱pcr引物的核苷酸序列為：

21、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌：

22、y.e-f：5’-biotin-ttcataacggtacttcaggt-3’；

23、y.e-r：5’-ctgtttatcaattgcgtct-3’；

24、惡臭假單胞菌：

25、p.p-f：5’-biotin-ccaaggtcgtttcca-3’；

26、p.p-r：5’-ggatgttcagcttgacg-3’；

27、擬態(tài)弧菌：

28、v.m-f：5’-biotin-atggaactgagccttgaag-3’；

29、v.m-r：5’-caccgcaaagaagcc-3’；

30、溶藻弧菌：

31、v.a-f：5’-biotin-cgttttgttggtgtttaggt-3’；

32、v.a-r：5’-cattcctgaactctggtgt-3’；

33、腸道沙門氏菌：

34、s.e-f：5’-biotin-attaacagtaccgcagga-3’；

35、s.e-r：5’-ctacttaacagtgctcgttt-3’；

36、霍亂弧菌；

37、v.c-f：5’-biotin-ccaagaaggtgactttattg-3’；

38、v.c-r：5’-cagcgaggacttcaaaac-3’；

39、福氏志賀氏菌：

40、s.f-f：5’-biotin-aagcctaccagccgta-3’；

41、s.f-r：5’-tcttcgaggatgatagtgc-3’；

42、阪崎克洛諾桿菌：

43、c.a-f：5’-biotin-gattttcgatgaagtgga-3’；

44、c.a-r：5’-gggtttcggtcatcg-3’；

45、腸出血性大腸桿菌：

46、e.coli-f：5’-biotin-aaaacactttatgaccgttgt-3’；

47、e.coli-r：5’-cgcagatatttgtcatcc-3’；

48、溶血性鏈球菌：

49、s.p-f：5’-biotin-ttggtaaccgttgaagc-3’；

50、s.p-r：5’-cggacgtaacttctaccat-3’；

51、副溶血弧菌：

52、v.p-f：5’-biotin-ctgccattcatttgatgta-3’；

53、v.p-r：5’-tttggccgtatctatcc-3’；

54、單細(xì)胞增生李斯特菌：

55、l.m-f：5’-biotin-gtctagtagaaaagaagaagtcc-3’；

56、l.m-r：5’-gtttcccaggaagtttg-3’；

57、創(chuàng)傷弧菌：

58、v.v-f：5’-biotin-gacttgttgtaatgtgggtt-3’；

59、v.v-r：5’-gatcgttgtttgaccgta-3’。

60、為了解決上述存在的技術(shù)問題，本發(fā)明結(jié)合多重不對(duì)稱pcr與dna微陣列技術(shù)，將13個(gè)不同的探針微陣列集成到微板的單個(gè)孔中并于一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)反應(yīng)；被固定在dna微陣列中的捕獲探針與經(jīng)過多重不對(duì)稱pcr擴(kuò)增后生成的大量目標(biāo)單鏈上的生物素化靶標(biāo)進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，被特異性捕獲，從而被檢測(cè)出。其采用的多重不對(duì)稱pcr引物與探針均具有較強(qiáng)的特異性，能區(qū)分種屬關(guān)系較親的細(xì)菌，如3種不同血清型的大腸桿菌，避免多重pcr存在多種限制的產(chǎn)生和產(chǎn)物之間相近的干擾情況發(fā)生，還能夠避免多種食源性致病菌檢測(cè)易出現(xiàn)假陽性的問題，不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，還具有更低的檢出限和更高的靈敏度，以及較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可直接定性分析結(jié)果，不僅大幅提高了檢測(cè)通量，還克服了pcr對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物尺寸依賴與凝膠電泳對(duì)微生物鑒定不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)13種靶標(biāo)菌的定性分析，滿足大規(guī)?？焖贆z測(cè)食源性致病菌的需求。

61、優(yōu)選地，所述試劑盒中dna芯片還包含陽性樣本探針，具體探針序列為ev71探針-p：5’-atgaagcatgtcagggcttggatacctcg-3’。

62、優(yōu)選地，所述固相載體為硝化纖維素膜。

63、更優(yōu)選地，所述dna芯片還包含核酸固定液和封閉液。

64、本發(fā)明提供的dna芯片可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備得到，作為最優(yōu)選地的方案：使用核酸固定試劑盒，其中包含硝化纖維素膜、核酸固定液和封閉液；將13種致病菌dna探針用純化水溶解，測(cè)定濃度后分別稀釋至50μm濃度，再將50μm的dna溶液與核酸固定液按照體積比1:4的比例混合混勻，得到13種致病菌dna探針點(diǎn)樣液；取硝化纖維素膜，用移液器分別將13種食源性致病菌dna探針點(diǎn)樣液依次點(diǎn)在硝化纖維素膜上，干燥箱50℃烘烤10min；烘烤后，將硝化纖維素膜浸沒在封閉液中，在50℃條件下浸泡10min，取出晾干，即得到dna芯片。

65、優(yōu)選地，所述試劑盒還含有能與多重不對(duì)稱pcr引物中生物素biotin進(jìn)行結(jié)合并產(chǎn)生顯色物質(zhì)的試劑，如采用于本領(lǐng)域常用的顯色反應(yīng)使用的核酸雜交試劑條及其成分。

66、更優(yōu)選地，所述核酸雜交試劑條(貨號(hào)：lo-nahyb，購自山東魯抗好麗友生物)，包括hybtm緩沖液、鏈霉親和素堿性磷酸酶偶聯(lián)物(strep-ap)、洗滌緩沖液、nbt/bcip和檢測(cè)緩沖液。

67、在提取待測(cè)食品樣品dna后，采用檢測(cè)13種食源性致病菌的多重不對(duì)稱pcr引物進(jìn)行多重不對(duì)稱pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與dna芯片進(jìn)行雜交和顯色。本發(fā)明提供試劑盒的可視化原理是：在dna芯片中被固定在硝化纖維素上的捕獲探針與經(jīng)過不對(duì)稱多重pcr生成的大量目標(biāo)單鏈上的生物素化靶標(biāo)進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，再通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)生成偶聯(lián)物，緩沖液中的5-溴-4-氯代-3'-吲哚酰磷酸鹽與該偶聯(lián)物發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，硝基藍(lán)四唑使該物質(zhì)沉淀，最終陽性結(jié)果在芯片上表現(xiàn)出穩(wěn)定的藍(lán)紫色雜交信號(hào)。

68、特別地，基于上述原理，只要是能與多重不對(duì)稱pcr引物中生物素biotin進(jìn)行結(jié)合并能產(chǎn)生顯色物質(zhì)的試劑，如中性親和素-hrp(neutravidin-hrp)，鏈霉親和素-ap(streptavidin-ap)，鏈霉親和素過氧化物酶(streptavidin-peroxidase)等，能與生物素組成的生物素-親和素(biotin-avidin)系統(tǒng)都能作為顯色試劑用于本發(fā)明試劑盒進(jìn)行顯色。

69、本發(fā)明提供所述可視化試劑盒在檢測(cè)食品中食源性致病菌的中的應(yīng)用。

70、優(yōu)選地，所述食源性致病菌為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、惡臭假單胞菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌、腸道沙門氏菌、霍亂弧菌、福氏志賀氏菌、阪崎克羅諾桿菌、腸出血性大腸桿菌、溶血性鏈球菌、副溶血性弧菌、單細(xì)胞增生李斯特菌和創(chuàng)傷弧菌中的一種或多種。

71、本發(fā)明還提供一種同時(shí)檢測(cè)13種食源性致病菌的方法，包括如下步驟：

72、s1.提取待測(cè)食品樣品dna；

73、s2.以步驟s1待測(cè)食品樣品dna為模板，采用上可視化試劑盒中檢測(cè)13種食源性致病菌的多重不對(duì)稱pcr引物進(jìn)行多重不對(duì)稱pcr擴(kuò)增；

74、s3.將步驟s2的擴(kuò)增產(chǎn)物與上述可視化試劑盒中dna芯片進(jìn)行雜交和顯色。

75、優(yōu)選地，步驟s2中進(jìn)行多重不對(duì)稱pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：12.5μl?pcr緩沖液、4μl正向引物、1.2μl反向引物、2.3μl無菌水和5μl?dna模板。

76、優(yōu)選地，步驟s2中進(jìn)行多重不對(duì)稱pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，1min；98℃，5s、46℃，5s、72℃?3s，32個(gè)循環(huán)；98℃?5s、65℃?5s、72℃?3s，18個(gè)循環(huán)。

77、優(yōu)選地，步驟s3中雜交和顯色使用核酸雜交試劑條(貨號(hào)：lo-nahyb，購自山東魯抗好麗友生物)進(jìn)行。

78、本發(fā)明具有以下有益效果：

79、本發(fā)明基于多重不對(duì)稱pcr與dna微陣列檢測(cè)技術(shù)，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)13種食源性致病菌的可視化試劑盒，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、惡臭假單胞菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌、腸道沙門氏菌、霍亂弧菌、福氏志賀氏菌、阪崎克羅諾桿菌、腸出血性大腸桿菌、溶血性鏈球菌、副溶血性弧菌、單細(xì)胞增生李斯特菌和創(chuàng)傷弧菌共13種食源性致病菌的檢測(cè)，不僅大幅提高了檢測(cè)通量，避免多重pcr存在多種限制的產(chǎn)生和產(chǎn)物之間相近的干擾情況發(fā)生，還克服了pcr對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物尺寸依賴與凝膠電泳對(duì)微生物鑒定不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，不會(huì)出現(xiàn)假陽性與復(fù)雜基質(zhì)的干擾，特異性高。

80、本發(fā)明研究得到13種致病菌的特異性dna探針與多重不對(duì)稱pcr檢測(cè)引物均具有較強(qiáng)的特異性，能區(qū)分種屬關(guān)系較親的細(xì)菌，如3種不同血清型的大腸桿菌，同時(shí)能夠避免多種食源性致病菌檢測(cè)易出現(xiàn)假陽性的問題，不僅縮短了同時(shí)檢測(cè)多種致病菌所需時(shí)間，還具有更低的檢出限和更高的靈敏度，以及較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可直接定性分析結(jié)果，能夠很好滿足大規(guī)模食品的快速檢測(cè)的需要。

81、本發(fā)明提供的可視化試劑盒具有小型化、高性能、并行處理樣品的能力和易于自動(dòng)化的特點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果在芯片表面被格式化為一個(gè)顏色點(diǎn)，通過肉眼即可對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性分析，這對(duì)提高檢測(cè)效率，節(jié)約檢測(cè)成本有顯著的影響，能夠滿足現(xiàn)代大規(guī)?？焖贆z測(cè)食源性致病菌的需求，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。