本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及oxct1蛋白酮體分解酶活性檢測方法。

背景技術(shù)：

1、酮體代謝是人體內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)的重要方式。酮體代謝為生物提供了替代的代謝能源，維持了人體細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。oxct1蛋白是酮體分解代謝中重要的代謝酶，其催化琥珀酰輔酶a上的輔酶a轉(zhuǎn)移至乙酰乙酸從而生成乙酰乙酰輔酶a。oxct1蛋白的酮體分解酶活對酮體代謝具有關(guān)鍵影響，且酮體代謝又是維持細(xì)胞增殖和生長的重要代謝方式。有研究報道，oxct1蛋白在乳腺癌中發(fā)揮酮體分解功能促進(jìn)乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。發(fā)明人先前研究發(fā)現(xiàn)，oxct1蛋白在肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，并通過其酮體分解功能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，同時oxct1蛋白的高表達(dá)與肝癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，因此抑制oxct1蛋白酮體分解酶功能對肝癌、乳腺癌、前列腺癌等oxct1高表達(dá)癌癥的治療具有臨床意義。

2、目前，急需開發(fā)穩(wěn)定可控的oxct1蛋白酮體分解酶活檢測體系，滿足藥物研發(fā)需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題。為此，本發(fā)明提出了oxct1蛋白酮體分解酶活性檢測方法和篩選oxct1蛋白酮體分解酶活抑制劑方法，利用該檢測方法可以極大地提高oxct1酮體分解酶活的檢測效率及通量，實現(xiàn)精準(zhǔn)控制，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步地推進(jìn)oxct1蛋白酮體分解小分子抑制劑的高通量篩選，為開發(fā)肝癌、胰腺癌、乳腺癌等oxct1高表達(dá)癌種的治療藥物提供支持。

2、在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種oxct1蛋白酮體分解酶活性檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：(1)分別配置起始液和mg2+溶液，所述起始液包括：oxct1蛋白液、緩沖液、碘乙酰胺溶液、琥珀酰輔酶a溶液和乙酰乙酰鋰溶液；(2)將所述mg2+溶液加入至所述起始液中并混勻，測定混合液的光信號值，記作第一光信號值；(3)待反應(yīng)至預(yù)定時間后，測定反應(yīng)液的光信號值，記作第二光信號值；(4)基于所述第一光信號值和第二光信號值，確定所述oxct1蛋白酮體分解酶活性。

3、在oxct1蛋白作用下，琥珀酰輔酶a溶液和乙酰乙酰鋰發(fā)生酮體分解反應(yīng)生成乙酰乙酰輔酶a，在此過程中溶液的光信號會發(fā)生變化，基于檢測單元對光信號實施檢測，可以確定乙酰乙酰輔酶a的生成情況，進(jìn)而獲知oxct1蛋白酮體分解酶活。碘乙酰胺的作用主要是保證蛋白質(zhì)樣品完全變性并保持還原狀態(tài)，維持反應(yīng)穩(wěn)定；緩沖液主要作用時維持體系的ph值；mg2+在體系中起到了“分子開關(guān)”作用，不存在mg2+時酮體分解反應(yīng)不會發(fā)生，存在mg2+時酮體分解反應(yīng)發(fā)生，而加入mg2+的時間先后不影響反應(yīng)最終產(chǎn)量。

4、進(jìn)一步地，若直接將mg2+溶液與起始液一同混合，則反應(yīng)瞬間發(fā)生，不利于光信號的檢測，可控性差，檢測結(jié)果穩(wěn)定性低，不利于實現(xiàn)藥物的高通量篩選。進(jìn)而，通過控制mg2+溶液加至起始液的時機(jī)以及檢測時機(jī)，可以實現(xiàn)精準(zhǔn)控制，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步地推進(jìn)oxct1蛋白酮體分解小分子抑制劑的高通量篩選，為開發(fā)肝癌、胰腺癌、乳腺癌等oxct1高表達(dá)癌種的治療藥物提供支持。

5、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述預(yù)定時間選自3.5～5.5min。由此，oxct1蛋白催化酮體分解反應(yīng)進(jìn)入平臺期，乙酰乙酰輔酶a的產(chǎn)量基本穩(wěn)定，通過測定此時的反應(yīng)液光信號值(即第二光信號值，例如od值)，與開始反應(yīng)0min時的光信號值(即第一光信號值，例如od值)比較，可以確定乙酰乙酰輔酶a的生成情況，進(jìn)而獲知oxct1蛋白酮體分解酶活。

6、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述oxct1蛋白液來源于細(xì)胞培養(yǎng)或者微生物培養(yǎng)。

7、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述oxct1蛋白液選自細(xì)胞裂解液或者經(jīng)微生物培養(yǎng)和純化處理后的蛋白液。

8、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述緩沖液選自ph?7～9tris-hcl緩沖液。由此，可以提供促進(jìn)酮體分解反應(yīng)發(fā)生的環(huán)境。

9、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述oxct1蛋白液選自含有oxct1蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)蛋白液，獲得方法包括：將過表達(dá)oxct1基因的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液；將所述培養(yǎng)液進(jìn)行裂解，離心，分離細(xì)胞碎片和蛋白上清液；去除所述蛋白上清液中的上層脂質(zhì)層，得到所述含有oxct1蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)蛋白液。

10、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述oxct1蛋白液選自含有oxct1蛋白的微生物培養(yǎng)蛋白液，獲得方法包括：將過表達(dá)oxct1基因的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌體；將所述菌體進(jìn)行超聲破碎，離心，收集上清液；利用可吸附oxct1蛋白的磁珠對所述上清液進(jìn)行分選，洗脫磁珠，將所得洗脫液濃縮，得到所述含有oxct1蛋白的微生物培養(yǎng)蛋白液。

11、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述起始液中琥珀酰輔酶a與乙酰乙酰鋰的摩爾比為1:3～1:7。由此，有助于促進(jìn)酮體分解反應(yīng)發(fā)生。

12、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述mg2+溶液選自mgcl2溶液，體積為10μl，濃度為100mmol/ml；所述起始液總體積為90μl，包括：1μl?20mm碘乙酰胺溶液；1μl?20mm琥珀酰輔酶a溶液；1μl?100mm乙酰乙酰鋰溶液；20μl1μg/μl含有oxct1蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)蛋白液，其中oxct1蛋白濃度為1μg/μl；或者4μl含有oxct1蛋白的微生物培養(yǎng)蛋白液，其中總蛋白濃度為1μg/μl；ph8.0tris-hcl緩沖液補足至90μl。由此，可以準(zhǔn)確地檢測oxct1蛋白酮體分解酶活性。

13、根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(4)包括：計算第一光信號值和第二光信號值的差值，代入乙酰乙酰輔酶a產(chǎn)量-od313值標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算乙酰乙酰輔酶a產(chǎn)量；基于所述乙酰乙酰輔酶a產(chǎn)量，判斷oxct1蛋白酮體分解酶活性。具體地，既可以采用定性判斷方式，例如，乙酰乙酰輔酶a產(chǎn)量值越高，表示oxct1蛋白酮體分解酶活性越高；反之，乙酰乙酰輔酶a產(chǎn)量值越低，表示oxct1蛋白酮體分解酶活性越低；也可以采用定量判斷方式，例如，1分鐘內(nèi)生成1微摩爾乙酰乙酰輔酶a所需的酶量，稱為一個酶活單位(u)。

14、在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種篩選oxct1蛋白酮體分解酶活抑制劑方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：利用前面所述oxct1蛋白酮體分解酶活性檢測方法，對預(yù)先與候選抑制劑共孵育的oxct1蛋白的酮體分解酶活性進(jìn)行檢測，得到檢測結(jié)果；基于所述檢測結(jié)果，確定所述候選抑制劑是否為目標(biāo)抑制劑。由此，利用該方法可以準(zhǔn)確、高效且高通量地篩選出目標(biāo)oxct1蛋白酮體分解酶活抑制劑，為開發(fā)肝癌、胰腺癌、乳腺癌等oxct1高表達(dá)癌種的治療藥物提供支持。

15、在一些實施例中，候選抑制劑既可以僅與oxct1蛋白共孵育，也可以與oxct1蛋白、起始液中除oxct1蛋白以外的其他至少之一成分共孵育，本發(fā)明不做嚴(yán)格限定。

16、需要說明的是，本發(fā)明對于“如何基于oxct1蛋白的酮體分解酶活性確定候選抑制劑是否為目標(biāo)抑制劑”的具體判斷方式不做嚴(yán)格限定，可以根據(jù)實際篩選目標(biāo)抑制劑的需求靈活選擇。例如，為了獲得高抑制率的目標(biāo)抑制劑，則選擇oxct1蛋白的酮體分解酶活性在共孵育前后酶活變化較大所對應(yīng)的候選抑制劑作為目標(biāo)抑制劑。

17、還需要說明的是，前面針對oxct1蛋白酮體分解酶活性檢測方法所描述的特征和優(yōu)點，同樣適用于該篩選oxct1蛋白酮體分解酶活抑制劑方法，在此不再贅述。

18、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。