本發(fā)明主要為分子育種技術(shù)以及細胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)和dna重組技術(shù)，主要涉及通過將水稻oscpc基因轉(zhuǎn)入模式生物擬南芥中來探究該基因的相關功能的研究方法，具體為轉(zhuǎn)水稻oscpc基因的重組載體、轉(zhuǎn)化細胞、以及轉(zhuǎn)oscpc基因的擬南芥的培育鑒定技術(shù)及應用。

背景技術(shù)：

1、水稻(oryza?sativa?l.)是全球最重要的糧食作物之一，在中國，水稻種植面積達到3007.6萬公頃，水稻總產(chǎn)2.1186億噸，為全世界一半以上的人口提供主食。但隨著人口數(shù)量的持續(xù)增加，耕地“非糧化”、“非農(nóng)化”和“拋荒撂荒”現(xiàn)象突出，如何提高水稻產(chǎn)量、保障我國乃至全世界的糧食安全是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的主要任務和重大課題[1]。

2、植物在進化過程中會不斷地演化出各種有效的調(diào)節(jié)機制來適應各類生物及非生物脅迫，而信號傳感和信號轉(zhuǎn)導是植物面對環(huán)境挑戰(zhàn)的重要途徑，涉及許多調(diào)節(jié)蛋白。其中，轉(zhuǎn)錄因子已被確定為非生物脅迫反應的關鍵調(diào)節(jié)因子。單個轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合存在于靶基因啟動子中的特定順式作用元件來調(diào)節(jié)許多下游基因的表達[2]。

3、caprice(cpc)是編碼r3型的myb類轉(zhuǎn)錄因子。擬南芥(arabidopsis?thaliana)是十字花科植物[3]，主要分布于亞歐大陸和非洲西北部，在我國的內(nèi)蒙、華南等地也有分布。擬南芥作為一種模式植物，其具有個體小、生活史短、種子量大且基因組小、重復序列少等特點[4-6]。cpc最早在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，cpc可以通過遷移進入h細胞競爭干擾wer與gl3/egl3-ttg1的結(jié)合來抑制wer-gl3/egl3-ttg1復合物的功能，從而抑制gl2的表達來促進根毛發(fā)育，其功能喪失的cpc突變體植株中發(fā)現(xiàn)了根毛的數(shù)量減少[7]，因此cpc被確定為充當根毛分化的正向調(diào)節(jié)劑和毛狀體形成的負向調(diào)節(jié)因子[8-9]，從而在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。雖然cpc是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要因此，但是其他重要農(nóng)作物中cpc的功能尚不清楚。

4、植物細胞骨架由微絲(actin?filament)和微管(microtubule)和中間纖維三部分組成[10-14]。其中，微絲又稱肌動蛋白微纖絲(filamentous?actin，f-actin)，廣泛地參與到細胞的各種生命活動中，在細胞分裂、囊泡運輸、細胞器的運動及空間分布、細胞壁合成、細胞形狀的維持和細胞分化中均發(fā)揮重要作用[15]。細胞中的微絲骨架是動態(tài)變化的，微絲骨架可以解聚和重新組裝，其解聚作用受肌動蛋白解聚因子(action?depolymerizingfactors，adf)調(diào)節(jié)控制[16-20]。實驗前期發(fā)現(xiàn)：擬南芥atcpc可以與atadf11上游啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控atadf11的表達進而調(diào)控，atcpc對atadf7也具有一定的調(diào)控作用，從而atcpc通過影響細胞骨架的動態(tài)變化調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

5、本發(fā)明在水稻中發(fā)現(xiàn)了cpc轉(zhuǎn)錄因子(oscpc基因)，通過基因拼接和dna重組技術(shù)，克隆水稻oscpc基因構(gòu)建表達載體，將水稻oscpc基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入擬南芥中，通過測表達量鑒定轉(zhuǎn)基因植株的成功率，在短時間內(nèi)得到轉(zhuǎn)基因植株，并且鑒定了oscpc轉(zhuǎn)基因植株在植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)作用。

6、水稻作為世界上一半人的主食。隨著人們生活質(zhì)量的提高，人們對水稻的需求量增大，高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)水稻就成為了當今市場的主角[21]。研究調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育基因并將其利用，可為作物遺傳改良和分子育種提供了重要的理論依據(jù)[22]，使育種進程加快，育種效率提高[23]。cpc轉(zhuǎn)錄因子對植物的生長發(fā)育起重要的作用，但cpc在水稻中還未見報道。因此，本發(fā)明提出水稻轉(zhuǎn)錄因子cpc轉(zhuǎn)基因植株的培育鑒定及應用方法將促進植物生長發(fā)育機理的研究，并為作物提高產(chǎn)量奠定了理論基礎。

7、參考文獻：

8、[1]劉宜林，范均怡，陳曉菲，徐淑月，張大兵，袁政.osap2-4調(diào)控水稻分蘗功能的初步研究[j].植物生理學報，2022，58(05)：817-824.doi：10.13592/j.cnki.ppj.100134.

9、[2]bo?c，chen?h，luo?g，li?w，zhang?x，ma?q，cheng?b，cai?r.maize?wrky114gene?negatively?regulates?salt-stress?tolerance?in?transgenic?rice.plant?cellrep.2020?jan；39(1)：135-148.doi：10.1007/s00299-019-02481-3.epub?2019?oct28.pmid：31659429.

10、[3]畢霜田.擬南芥微絲結(jié)合蛋白vln1調(diào)節(jié)根毛生長作用機制的研究[d].沈陽農(nóng)業(yè)大學，2019.doi：10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000155.

11、[4]陳璋.擬南芥：植物分子生物學研究的模式物種[j].植物學通報，1994(01)：6-11.)

12、[5]奚豪，李哲，方治國，劉惠君.不同碳鏈長度離子液體對模式植物擬南芥和小麥的光合致毒效應[j].生態(tài)毒理學報，2022，17(04)：426-432.

13、[6]張利，徐舟，單鳳嬌，肖玖金，劉建霞，李旭華，劉千里.岷江干旱河谷不同植被恢復技術(shù)模式植物多樣性特征[j].四川林業(yè)科技，2022，43(05)：34-40.

14、[7]wada?et?al.1997；lee?and?schiefelbein，2002；tominaga?et?al.2007；songet?al.2011；kang?et?al.2013

15、[8]李洪朋.擬南芥根毛生長發(fā)育中轉(zhuǎn)錄因子atcpc調(diào)節(jié)微絲解聚因子atadf11的作用研究[d].沈陽農(nóng)業(yè)大學，2020.doi：10.27327/d.cnki.gshnu.2020.000200.

16、[9]王艷鴿，李祖亮，楊金娜，曹穎.r3-myb類轉(zhuǎn)錄因子在植物表皮毛發(fā)育中的研究進展[j].分子植物育種，2019，17(14)：4667-4673.doi：10.13271/j.mpb.017.004667.

17、[10]王瑾書.微絲解聚蛋白atadf8調(diào)節(jié)擬南芥根毛生長的作用研究[d].沈陽農(nóng)業(yè)大學，2022.doi：10.27327/d.cnki.gshnu.2022.000832.

18、[11]劉江濤.擬南芥adf5參與調(diào)控種子發(fā)育及其成束微絲機理研究[d].蘭州大學，2016.

19、[12]葉佳.低溫脅迫下擬南芥肌動蛋白解聚因子adf5的功能研究[d].蘭州大學，2010.

20、[13]王敏君，劉清桂，陳費.細胞骨架中微絲觀察實驗的優(yōu)化探索[j].基礎醫(yī)學教育，2022，24(10)：750-752.doi：10.13754/j.issn2095-1450.2022.10.06.

21、[14]吳航楓.利用生物學實例深入理解細胞骨架的功能[j].生物學通報，2022，57(06)：9-11.

22、[15]王冰肖，李杰婕.微絲骨架調(diào)控植物免疫機制的研究進展[j].中國科學：生命科學，2022，52(08)：1203-1211.

23、[16]maciver?s?k，hussey?p?j.the?adf/cofiin?family：actin-remodelingproteins[j].genome?biology，2002，3(5)：3007.1-3007.12.)

24、[17]王秋陽.微絲解聚因子atadf1在擬南芥葉片發(fā)育中的功能分析[d].沈陽農(nóng)業(yè)大學，2019.doi：10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000844.

25、[18]王楠，呂香玲，李亮，吳金鳳，尚佳微，郝轉(zhuǎn)芳，李鳳海.植物肌動蛋白解聚因子adf的研究進展[j].西北植物學報，2015，35(11)：2349-2354

26、[19]南瓊.植物微絲解聚因子adf在進化過程中功能發(fā)生分化的分子機制研究[d].蘭州大學，2017.

27、[20]kijima?s?t，hirose?k，kong?s?g，et?al.distinct?biochemicalproperties?of?arabidopsis?thaliana?actin?isoforms[j].plant?cell?physiol，2016，57：46-56.)

28、[21]hori?k.genetic?dissection?and?breeding?for?grain?appearancequality?in?rice.in：sasaki?t.，ashilari?m.，editors.rice?genomics，genetics?andbreeding.springer；singapore：2018.pp.435-451.)

29、[22]張瑞杰，王喆，連卜穎，郭展，魏東，于世慧，李紅英，劉曉東.谷子abc轉(zhuǎn)運蛋白基因與抗旱關系的研究[j].山西農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2018，38(01)：11-15

30、[23]宋健，曹曉寧，王海崗，陳凌，王君杰，劉思辰，喬治軍.siasrs家族基因的鑒定及表達分析[j].作物雜志，2019(06)：33-42.

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提出一種轉(zhuǎn)水稻oscpc基因的培育、鑒定方法，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將水稻的oscpc基因?qū)霐M南芥中，并通過測表達量來探究oscpc的功能。本發(fā)明的主要目的，是利用下列的方法進行研究的：

2、利用農(nóng)桿菌花序浸染法，將水稻oscpc基因?qū)霐M南芥，通過含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選抗性植株；

3、對已得到的具有卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化植物，通過pcr、定量rt-及pcr的檢測，終于證實了水稻oscpc基因能夠進入擬南芥中，并轉(zhuǎn)錄為mrna；對轉(zhuǎn)基因擬南芥后代進行了表達量的檢測，終于獲得了能夠表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。

4、本發(fā)明的技術(shù)要點為：

5、1.本發(fā)明選用重組載體，該重組載體包括序列如seq?id?no.1所示oscpc基因，通過dna連接酶將oscpc基因連接到質(zhì)粒載體上。

6、2.本發(fā)明也可包括了作為上述1的生物重組載體的轉(zhuǎn)化細胞。

7、3.本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)oscpc基因擬南芥的培育方法，該方法以水稻為材料獲得目的基因oscpc，通過酶切連接與植物表達載體pcambia1300-egfp質(zhì)粒進行重組連接，通過農(nóng)桿菌介導法將oscpc基因?qū)霐M南芥。

8、4.本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)oscpc基因擬南芥的培育方法，該方法包括如下步驟：

9、(1)水稻oscpc基因的克隆

10、以水稻為材料，提取rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，根據(jù)基因序列信息設計特異性引物：

11、正向引物oscpc-f：序列如seq?id?no.2所示；

12、反向引物oscpc-r：序列如seq?id?no.3所示，獲得oscpc基因序列；

13、結(jié)合pcr擴增目的基因的全長序列，在oscpc基因的上游和下游分別引入bamh?i和xba?i酶切位點，設計引物：

14、正向引物oscpc-2f：序列如seq?id?no.4所示；

15、反向引物oscpc-2r：序列如seq?id?no.5所示，獲得pcr產(chǎn)物；

16、(2)植物表達載體pcambia1300-egfp-oscpc的構(gòu)建

17、將步驟(1)得到的pcr產(chǎn)物連接到pgm-t質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細胞，分離提取陽性質(zhì)粒，然后用限制酶xba?i和bamh?i分別對提取的質(zhì)粒載體pcambia1300-egfp載體進行雙酶切，酶切產(chǎn)物通過pcr電泳檢測后回收；再用t4連接酶過夜連接回收的酶切產(chǎn)物；最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α大腸桿菌，提取陽性質(zhì)粒并進行雙酶切驗證。

18、(3)農(nóng)桿菌gv3101介導遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥

19、將步驟(2)制備的陽性質(zhì)粒pcambia1300-egfp-t-oscpc轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)gv3101，獲得陽性克隆農(nóng)桿菌，通過浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，將oscpc基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

20、5.上述1提供的重組載體在培育抗旱性擬南芥上的應用。

21、6.上述2提供的轉(zhuǎn)化細胞在培育抗旱性擬南芥上的應用。

22、7.上述3或4提供的轉(zhuǎn)oscpc基因擬南芥的培育方法在抗旱性轉(zhuǎn)基因擬南芥株系培育上的應用。

23、8.通過上述3或4提供的培育方法獲得抗旱性擬南芥的應用。

24、9.轉(zhuǎn)oscpc基因擬南芥的鑒定方法，該鑒定方法將轉(zhuǎn)oscpc基因初步獲得轉(zhuǎn)化植株進行pcr鑒定、熒光定量rt-pcr分子檢測，篩選陽性植株，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。

25、具體步驟如下：

26、(1)pcr檢測

27、提取生根篩選得到的卡那霉素抗性待檢測植株基因組dna，將篩選基因nptii作為檢測目標，根據(jù)npt?ii基因兩端合成擴增反應引物，擴增出的片段長為430bp，引物序列為：

28、正向引物pcambia1300-egfp-npt?ii-f：序列如seq?id?no.6所示；

29、反向引物pcambia1300-egfp-npt?ii-r：序列如seq?id?no.7所示；

30、分別以卡那霉素抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株dna為模板，以pcambia1300-egfp-nptii-f和pcambia1300-egfp-npt?ii-r為引物，進行pcr擴增，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析；

31、(2)熒光定量rt-pcr檢測

32、分別抽取抗卡那霉素植物根和野生的植物根中的rna、反轉(zhuǎn)錄后的cdna，并進行了熒光定性rt-pcr測定(一個標本循環(huán)3次)。通過熒光定量法rt-pcr的分析得出了各個樣品的ct值，以野生種植物的相對表達水平為基準值，并統(tǒng)計了各轉(zhuǎn)基因植物的相對表達水平；而通過特異引物擴增得到的片段長度為230bp，引物順序為：

33、正向引物oscpc-rt-f：序列如seq?id?no.8所示，

34、反向引物oscpc-rt-r：序列如seq?id?no.9所示；

35、以18s擴增的基因片段為內(nèi)參，片段長度為186bp陽性結(jié)果，引物序列：

36、正向引物18s-f：序列如seq?id?no.10所示，

37、反向引物18s-r：序列如seq?id?no.11所示；

38、由熒光定量rt-pcr檢測呈陽性，確定獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。

39、本發(fā)明的有益效果：

40、1.本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將水稻oscpc基因融合到了擬南芥基因組上，將有助于從根本上增強擬南芥的抗逆功能。轉(zhuǎn)化外源oscpc基因并正常轉(zhuǎn)錄表達后，在干旱脅迫環(huán)境下篩選出抗旱的擬南芥植株，為水稻oscpc基因的相關功能的后續(xù)研究奠定基礎。

41、2.通過對后續(xù)的實驗分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本實驗方法選育的轉(zhuǎn)基因擬南芥材料與對照組相比，轉(zhuǎn)入了oscpc基因的擬南芥植株耐旱能力得到了很大提高，在不同濃度甘露醇處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的oscpc基因表達量均顯著高于對照組、從而明顯提高了擬南芥的耐旱能力。