本發(fā)明屬于精細化工，具體涉及一種以吡啶取代喹啉腈為母核的多種生物標志物檢測探針的構建方法及應用。

背景技術：

1、乙酰膽堿酯酶、活性氧物種、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及酯酶等，作為神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默癥、抑郁癥)(j.am.chem.soc.2019,141,2061-2068.nat.commun.,2022,13,998)惡性腫瘤(如胰腺癌、肝癌、卵巢癌)(angew.chem.int.ed.2020,59,2-12，chem.sci.,2019,10,398-405)的特異性標志物，對于實現(xiàn)疾病的特異性診療至關重要。

2、近紅外(nir)小分子聚集誘導發(fā)光(aie)染料是開發(fā)可激活熒光探針的首選材料(angew.chem.int.ed.,2020,59,9812-9825.)。然而，由于aiegens的水溶性較差，其在水或生物系統(tǒng)中實現(xiàn)激活型熒光響應仍然存在巨大挑戰(zhàn)(adv.mater.,2022,34,2107444.)。目前報道的酶響應aie探針主要基于提高探針的水溶性并通過調節(jié)其聚集態(tài)行為來實現(xiàn)“off-on”的特異性熒光響應(j.am.chem.soc.,2019,141,3171-3177.)。具體來說可以分為靶向型和酶切響應型，主要通過水溶性的單元提升探針在水中的初始溶解狀態(tài)，在靶向聚集或者酶切導致溶解度下降之后發(fā)生聚集，產(chǎn)生aie信號，實現(xiàn)對特定物質的響應，這種方法對溶液中的體外檢測有效(bioconjugate?chem.,2020,31,276-292.)。然而，生物系統(tǒng)不是純水環(huán)境，很多生物干擾物容易引起探針的不良聚集，產(chǎn)生假陽性信號(acs?nano,2023,17,15,14347-14405.)。因此，提高探針的水溶性并通過操縱激發(fā)態(tài)能量流向，共同猝滅探針的初始熒光對構建應用于特異性生物標志物檢測的aie可控激活型熒光探針非常重要。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有熒光探針存在的不足，本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有aie熒光探針在生物環(huán)境應用遇到的困難，通過調控聚集態(tài)及激發(fā)態(tài)能量，提高生物相容性、降低熒光量子產(chǎn)率，并實現(xiàn)對相關生物標志物可視化檢測。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

3、本發(fā)明第一方面，提供了一種激活型喹啉腈聚集誘導發(fā)光探針，結構如下式ⅰ所示：

4、

5、式ⅰ中，

6、其中r1選自中的一種；

7、r2選自氫、碳鏈、鹵素或其同位素、羥基、巰基、氨基、羧基、磺酸基、磷酸基、二甲氨基、三甲胺基、吡啶或其衍生物、酯基或其衍生物或聚乙烯鏈中的一種；

8、r3選自三苯胺、n,n-二苯基-4-(噻吩-2-基)苯胺、n,n-二甲基-4-(噻吩-2-基)苯胺、1-乙基-4-苯基吡啶鎓、n,n-二甲基苯胺、9-(噻吩-2-基)-9h-咔唑、2-(9h-芴-9-基)噻吩中的一種；

9、r4選自下式中的任意一種：

10、

11、其中x為o或n。

12、優(yōu)選的，該探針的結構選自如下任意一種：

13、

14、本發(fā)明第二方面，提供了上述激活型喹啉腈聚集誘導發(fā)光探針的制備方法，包括以下步驟：以吡啶取代喹啉腈為原料，通過knoevenage縮合反應連接r3，再通過取代反應連接r4基團，反應路線如下：

15、

16、具體制備步驟如下：

17、a、染料ache-qm的合成

18、

19、在反應容器中加入摩爾比為5:6的py-qm和ache-i，并加入有機溶劑(優(yōu)選乙腈)溶解，惰性氣體(如氮氣)保護下加熱回流10～14h(優(yōu)選12h)，反應結束后，旋干溶劑，dcm:meoh＝20:1的硅膠柱色譜分離，得產(chǎn)物ache-qm；

20、b、產(chǎn)物合成

21、在反應容器中，將ache-qm、有機溶劑、r4和哌啶依次加入，其中，ache-qm與r4之間的摩爾比為3:4～4:5，有機溶劑和哌啶之間的體積比為30:1，ache-qm的摩爾濃度為0.02～0.03mol/l；

22、在惰性氣體(如氮氣)保護下，加熱至100℃，攪拌回流8h反應充分后，去除反應溶液，經(jīng)dcm:meoh＝10～20:1硅膠色譜分離，得產(chǎn)物ache-qm-tpe。

23、本發(fā)明第三方面，提供了上述所述的激活型喹啉腈聚集誘導發(fā)光探針在制備酶或活性氧檢測試劑中的應用，其中，所述酶為乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或酯酶。

24、檢測步驟如下：制備探針儲備液，將探針儲備液稀釋到一定濃度，與待測物質、細胞或活體進行孵育、注射、檢測。

25、優(yōu)選的，檢測濃度為0.01-100μm；儲備液溶劑選自二甲基亞砜、四氫呋喃、甲醇、乙醇、甲苯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、水、緩沖液中的任意一種或多種；所述緩沖液選自3-羥甲基氨基甲烷溶液、磷酸鹽緩沖液，羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液，醋酸鹽緩沖液，tris緩沖液，碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，hepes緩沖液中的任意一種或多種。

26、具體應用方面，本發(fā)明可以實現(xiàn)體外對乙酰膽堿酯酶、活性氧的實時線性響應；可以實現(xiàn)神經(jīng)元細胞內(nèi)乙酰膽堿酯酶的可視化成像；可以繪制顱內(nèi)乙酰膽堿酯酶分布；可以實現(xiàn)胰腺癌中活性氧物種的可視化成像。

27、酶響應測試：在上述探針溶液中加入不同當量(可描述為濃度、酶活)的特異性生物標志物，測試在不同時間點的紫外吸收和熒光響應情況。

28、細胞成像：將細胞轉移到具有1.0ml培養(yǎng)基的nest共聚焦小皿中培養(yǎng)12h。加入所需濃度的探針，37℃孵育相應的時間，再加入pbs洗滌，除去未攝入的探針。然后使用leicatcs?sp8激光顯微鏡進行共聚焦熒光成像。在所屬探針對于激發(fā)和發(fā)射波長處采集探針培養(yǎng)的細胞熒光信號。

29、活體成像：對于不同小鼠模型，采用尾靜脈、腹腔或原位注射方式進行給藥，在不同時間點采集活體熒光成像。

30、組織切片及完整組織離體成像：在上述活體成像完成后，處死小鼠，經(jīng)解剖獲取不同組織器官。組織切片成像：對特定組織或器官進行切片處理(包括冰凍和石蠟)，獲取相應切片，切片成像方式同細胞成像。組織離體成像：對組織進行透明化處理，然后根據(jù)特定探針波長，通過光片顯微鏡成像采集數(shù)據(jù)，經(jīng)配準、三維重構等技術手段處理數(shù)據(jù)，實現(xiàn)完整組織的可視化成像。

31、本發(fā)明第四方面，提供了一種酶或活性氧檢測試劑，包括激活型喹啉腈聚集誘導發(fā)光探針以及溶劑。其中，酶為乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或酯酶；激活型喹啉腈聚集誘導發(fā)光探針以及溶劑均如上所述。

32、本發(fā)明的有益技術效果：

33、效果方面，本發(fā)明提供的aie探針可以實現(xiàn)乙酰膽堿酯酶、ros的超靈敏檢測，具有快速線性響應；同時該aie探針還實現(xiàn)了細胞內(nèi)標志物的檢測，以及衰老小鼠顱內(nèi)乙酰膽堿酯酶檢測與分布繪制。

34、制備技術方面，本發(fā)明的aie探針的制備方法簡單，不需要苛刻的反應條件，有利于后續(xù)的擴大化試驗或生產(chǎn)。