本發(fā)明屬于微衛(wèi)星標(biāo)記，具體涉及一種基于微衛(wèi)星片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的引物及其方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、魚類的準(zhǔn)確鑒定對于生態(tài)學(xué)研究、水產(chǎn)養(yǎng)殖和保護(hù)生物多樣性至關(guān)重要。魚類作為最原始的脊椎動物，是生物進(jìn)化史中存在雜交的一大類群，表現(xiàn)出原始性、復(fù)雜性及多樣性。（魚芒）科魚類是一類高度多樣化的類群，一些具有高度相似特征的物種難以通過形態(tài)進(jìn)行識別，系統(tǒng)分類關(guān)系混亂，因此，選擇一種更為有效、便捷的魚類鑒定和分類方法十分必要。

2、蘇氏圓腹（魚芒）（ pangasius?sutchi或 pangasianodonhypophthalmus）屬于鲇形目中的巨鲇科，為無齒（魚芒）屬。該物種廣泛分布于泰國、馬來西亞、越南、老撾等東南亞國家，是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)魚類。中國引入該品種已逾30年，主要在廣西、廣東、海南和四川等地養(yǎng)殖。這種熱帶雜食性魚類生長速度快，抗病力強(qiáng)，適應(yīng)低氧環(huán)境，且出肉率高，肉質(zhì)鮮嫩無刺。此外，其魚皮可用于制作明膠，魚骨可提取藥用成分硫酸軟骨素，因而是優(yōu)良的淡水養(yǎng)殖品種。長絲（魚芒）（ pangasius?sanitwongseismith,?1931）同樣屬于鲇形目，巨鲇科的（魚芒）屬，原產(chǎn)于湄南河與湄公河流域。長絲喜歡棲息于深水區(qū)，以攝食魚、蝦、蟹等水生動物為主食，其產(chǎn)卵期集中在4～5月。這種魚肉質(zhì)鮮美、生長速度快，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。同時(shí)，其具有觀賞價(jià)值，其寬闊的頭部及獨(dú)特的游動姿態(tài)深受觀賞魚類養(yǎng)殖者喜愛。然而，近年來由于過度捕撈、環(huán)境污染、棲息地破壞以及水電站大壩建設(shè)等因素的影響，洄游性長絲的數(shù)量迅速減少，野生種群已瀕臨滅絕邊緣。根據(jù)《中國瀕危動物紅皮書·魚類》和《中國物種紅色名錄（第一卷）》，其瀕危等級分別為稀有(r)和易危(vu)，在國際自然保護(hù)聯(lián)盟（ucn）瀕危物種紅色名錄中處于極危(cr)等級。

3、目前，使用傳統(tǒng)分類工具在港口檢查期間識別重要經(jīng)濟(jì)魚類異常困難，甚至不可能；這是因?yàn)樵诤Ｉ线M(jìn)行加工時(shí)導(dǎo)致頭部和鰭被移除，從而使得準(zhǔn)確識別標(biāo)本所需的形態(tài)學(xué)和分生標(biāo)準(zhǔn)喪失。為解決這一問題和揭示捕獲的瀕危鯊魚物種，目前已開發(fā)多種遺傳鑒定方法，包括基于凝膠、dna條形碼、基于細(xì)胞色素b序列、微衛(wèi)星標(biāo)記和高分辨率熔解分析的基因測序方法。其中，微衛(wèi)星(microstatelites)又名簡單重復(fù)序列(simple?sequencerepeat，ssr)，是基因組內(nèi)以2-6堿基（bp）為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，具有多態(tài)性高、共顯性、在基因組上廣泛分布等特點(diǎn)。微衛(wèi)星標(biāo)記檢測方法操作簡便、重復(fù)性好，常用作種群遺傳學(xué)研究、親緣關(guān)系和譜系分析、物種鑒定和保護(hù)生物學(xué)等。近期研究表明，跨物種微衛(wèi)星在基于物種特異性等位基因大小和多個(gè)位點(diǎn)的獨(dú)特等位基因頻率方面發(fā)揮重要作用。因此，可基于物種間的微衛(wèi)星標(biāo)記片段大小的差異，開發(fā)適用于（魚芒）魚的分子標(biāo)記，以更好地鑒別蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）。

4、三代測序平臺pacbio?sequelⅱ利用smrt測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了單分子實(shí)時(shí)測序。該技術(shù)基于smrt?cell，每個(gè)cell上布滿了數(shù)百萬個(gè)零模波導(dǎo)孔（zmw）。在測序過程中，dna聚合酶和一條模板分子被定位在zmw孔底部進(jìn)行反應(yīng)。激發(fā)光位于孔底部能夠激發(fā)核苷酸底物上的熒光標(biāo)記，通過監(jiān)測系統(tǒng)記錄熒光信號，獲得堿基信息。整個(gè)測序過程無需pcr擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對每一條dna分子的單獨(dú)測序。pacbio?sequelⅱ具有長讀長、高產(chǎn)出、高一致性準(zhǔn)確度、均勻的覆蓋度、高精準(zhǔn)度的長讀長hifi?reads以及可進(jìn)行單倍體組裝等優(yōu)點(diǎn)。三代測序在物種基因組分析和組裝中扮演重要角色，其高分辨率顯著提高了物種基因組組裝的完整性。利用基因組單倍型組裝獲取蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的單倍型，基于單倍型分析尋找共有且存在片段大小差異的微衛(wèi)星序列，開發(fā)適用于區(qū)分二者的分子標(biāo)記，有助于增殖放流、港口、海關(guān)等進(jìn)行高效準(zhǔn)確的物種鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于微衛(wèi)星片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的引物及其方法和應(yīng)用。該方法通過提取蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）個(gè)體樣本的基因組dna；利用所限定的1對引物對獲得的dna基因組進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用1.5%?瓊脂糖凝膠對pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳、顯影；根據(jù)特異性片段大小區(qū)分蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）。該方法簡單便捷、準(zhǔn)確高效，采用該引物和方法可精準(zhǔn)鑒定區(qū)分蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒），為批量高效鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）提供技術(shù)基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種基于微衛(wèi)星片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的引物，所述引物為引物對ps-py-chr-4-1，該引物對的序列如下表1所示：

4、

5、進(jìn)一步的，所述的引物對ps-py-chr-4-1的序列依序分別如seq?id?no：1～2所示。

6、所述的引物（ps-py-chr-4-1）在鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）中的應(yīng)用。

7、另一方面，本發(fā)明還提供了一種基于微衛(wèi)星標(biāo)記片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的方法，具體包括以下步驟：

8、（1）蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）基因組dna提?。翰杉K氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）的尾鰭組織樣品，分別提取基因組dna；

9、（2）合成上述的1對微衛(wèi)星標(biāo)記引物：ps-py-chr-4-1；

10、（3）pcr反應(yīng)擴(kuò)增：分別取所述步驟（1）獲取的蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）基因組dna和步驟（2）合成的1對微衛(wèi)星標(biāo)記引物進(jìn)行pcr反應(yīng)；

11、（4）基因分型：將pcr產(chǎn)物在1.5%?瓊脂糖膠上電泳，以dl2000?maker為片段大小的參考，通過凝膠成像系統(tǒng)顯影檢測pcr產(chǎn)物；

12、（5）物種判定：蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）的ps-py-chr-4-1pcr產(chǎn)物的片段大小分別為382bp、242bp，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性片段大小鑒定區(qū)分蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）。

13、進(jìn)一步的，上述的基于微衛(wèi)星標(biāo)記片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的方法，步驟（1）中：采集蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）的尾鰭組織樣品，采用高鹽法、酚/氯仿提取法、商業(yè)化dna提取試劑盒或磁珠法等方法提取獲得每個(gè)個(gè)體的基因組dna，保存?zhèn)溆谩?/p>

14、進(jìn)一步的，上述基于微衛(wèi)星標(biāo)記片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的方法，步驟（3）中，pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min，95℃變性40s，50℃退火30s，72℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5min，4℃保存。pcr反應(yīng)體系為：7.5μl?taq酶pcr預(yù)先混合液，1.0?μl模板基因組dna，上下游擴(kuò)增引物各0.5μl、濃度10um，加5.5μl?ddh2o至總體積15μl；所述taq酶pcr預(yù)先混合液中的主要成分為0.1?u/μl?taq?dna聚合酶、2?x?pcr反應(yīng)緩沖液、3?mm?mgcl2，以及0.4?mm?dntps。

15、進(jìn)一步的，上述基于微衛(wèi)星標(biāo)記片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的方法，步驟（3）中，蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）基因組dna的濃度為50±20?ng/μl，上下游擴(kuò)增引物濃度10?μm。

16、注：本文中所述的（魚芒）為一個(gè)字，由于該字是生僻字未能顯示出來，因此用魚芒兩個(gè)字來拼，并括號起來進(jìn)行表示。

17、本發(fā)明的有益效果為：

18、1、本發(fā)明公開了一種基于微衛(wèi)星片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的引物及其方法和應(yīng)用，采用該引物和方法可精準(zhǔn)鑒定區(qū)分蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）；該方法是基于二者基因組單倍型作為基礎(chǔ)，進(jìn)行基因組單倍型比較分析，查找二者共有且存在片段大小差異的微衛(wèi)星標(biāo)記，基于該序列片段分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并驗(yàn)證，經(jīng)群體驗(yàn)證之后，發(fā)現(xiàn)該引物可以準(zhǔn)確鑒定蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒），準(zhǔn)確率為100%。本發(fā)明為批量鑒定蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

19、2、本發(fā)明利用三代測序與二代測序相結(jié)合，組裝出高質(zhì)量的蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）單倍型，通過親本單倍型比較獲得二者共有且存在片段大小差異的微衛(wèi)星標(biāo)記，依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行微衛(wèi)星分型，對蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）進(jìn)行了高效的物種鑒定。

20、3、本發(fā)明篩選的1個(gè)特異性微衛(wèi)星標(biāo)記，主要為二者共有且存在片段大小差異、擴(kuò)增效果穩(wěn)定、清晰、特異性強(qiáng)，為后期數(shù)據(jù)規(guī)整提供了較客觀的依據(jù)，僅使用1對引物即可完成蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的鑒定，大大降低了鑒定成本和工作量，提高了鑒定效率。

21、4、本發(fā)明公開的一種基于微衛(wèi)星片段大小鑒定蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒）的方法，主要利用1個(gè)跨物種穩(wěn)定表達(dá)的特異性核基因微衛(wèi)星標(biāo)記作為物種鑒定方法，可鑒別出蘇氏圓腹（魚芒）和長絲（魚芒），方法簡便、快捷、準(zhǔn)確、效率高，為快速鑒定這兩種物種奠定了可靠的基礎(chǔ)。本發(fā)明方法可用于蘇氏圓腹（魚芒）、長絲（魚芒）的種質(zhì)鑒定、家系遺傳管理、增殖放流效果評估等方面，應(yīng)用前景廣闊。