本發(fā)明涉及生物，具體地，本發(fā)明涉及雙特異性抗體及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及能夠特異性識(shí)別vegf和/或ang-2的單域抗體、抗體或融合蛋白、雙特異性抗體、核酸分子、表達(dá)載體、重組細(xì)胞、藥物組合物、制藥用途及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)是新血管形成的關(guān)鍵因素。vegf能誘導(dǎo)已有血管的再生或新血管的生長(血管發(fā)生)，因此是胚胎發(fā)育、血管修復(fù)的關(guān)鍵。vegf家族包括vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e以及胎盤生長因子1、2(分別為pigf-1、pigf-2)。vegf的家族成員通過與三個(gè)酪氨酸激活酶受體結(jié)合，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)信號：vegf-a、vegf-b優(yōu)先與vegfr-1結(jié)合；vegf-a、vegf-c、vegf-d、vegf-e可與vegfr-2結(jié)合；vegf-c、vegf-d與vegfr-3(僅在造血細(xì)胞中表達(dá))結(jié)合。因此，對vegf信號通路的抑制，可以治療血管生成引起的眼科相關(guān)的疾病。

2、ang-2屬于血管生成素家族，由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，通常儲(chǔ)存于內(nèi)皮細(xì)胞韋博小體(weibel-paladebodies)，當(dāng)遇到缺氧、炎癥等促進(jìn)新生血管形成的情況，ang2從韋博小體釋放出來和ang1競爭，作為tie2的拮抗劑抑制血管的穩(wěn)定性，使周細(xì)胞從內(nèi)皮細(xì)胞上脫離下來，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，使vegf更好的發(fā)揮促進(jìn)新生血管形成的作用。

3、本領(lǐng)域內(nèi)cn117545503a、cn116925234a雖有公開關(guān)于vegf和/或ang-2的特異性抗體，但開發(fā)對vegf和/或ang-2具有較優(yōu)結(jié)合特異性的新型抗體對于血管生成相關(guān)疾病的診斷和治療仍具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了可以特異性結(jié)合vegf和/或ang-2的特異性抗體。本發(fā)明的抗體具有與vegf和/或ang-2較高的結(jié)合活性，可以有效阻斷vegf、ang-2與其各自受體的結(jié)合，具有抑制血管生成和減少血管炎癥的作用，能夠有效治療或預(yù)防血管生成導(dǎo)致的相關(guān)疾病，尤其是眼科相關(guān)疾病。

2、在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種能夠特異性識(shí)別vegf的單域抗體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，

3、所述抗體的重鏈可變區(qū)包含hcdr1，hcdr2和hcdr3，其中：

4、hcdr1包含seq?id?no:1、4或7所示的序列，或者與seq?id?no:1、4或7具有至少80％同一性的氨基酸序列；

5、hcdr2包含seq?id?no:2、5、8或25所示的序列，或者與seq?id?no:2、5、8或25具有至少80％同一性的氨基酸序列；

6、hcdr3包含seq?id?no:3、6或9所示的序列，或者與seq?id?no:3、6或9具有至少80％同一性的氨基酸序列。

7、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述抗體均具有明確的對vegf-c與vegf-r2結(jié)合的阻斷功能，阻斷效力較優(yōu)。

8、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述抗體或抗原結(jié)合片段還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

9、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體包括：

10、分別如seq?id?no:1、2和3或者與seq?id?no:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的hcdr1，hcdr2和hcdr3序列；或者

11、分別如seq?id?no:4、5和6或者與seq?id?no:4、5和6具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的hcdr1，hcdr2和hcdr3序列；或者

12、分別如seq?id?no:7、8和9或者seq?id?no:7、8和9具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的hcdr1，hcdr2和hcdr3序列；或者

13、分別如seq?id?no:7、25和9或者seq?id?no:7、25和9具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的hcdr1，hcdr2和hcdr3序列。

14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地，所述抗體包括：

15、分別如seq?id?no:7、25和9或者seq?id?no:7、25和9具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的hcdr1，hcdr2和hcdr3序列。

16、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體包含如seq?id?no：10-12或seq?id?no：17所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或與所述seq?id?no：10-12或seq?id?no：17所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有所示氨基酸序列的抗vegf單域抗體，與vegf-c具有強(qiáng)力的結(jié)合能力，同時(shí)不與不相關(guān)靶點(diǎn)抗原結(jié)合。

17、優(yōu)選地，所述抗體包含如seq?id?no：17所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或與所述seq?id?no：17所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

18、在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種抗vegf單域抗體的融合蛋白，包含前述的抗vegf單域抗體和igg的fc片段。

19、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述fc片段包含seq?id?no：13所示的氨基酸序列，或與所述seq?id?no：13所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

20、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗vegf抗體的融合蛋白包含如seq?id?no：14-16、或seq?id?no：28任一項(xiàng)所示的氨基酸序列。發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有所示氨基酸序列的抗vegf抗體(或fc融合蛋白)具有明確的對vegf-c與vegf-r2結(jié)合的阻斷功能。

21、優(yōu)選地，所述抗vegf抗體的融合蛋白包含如seq?id?no：28所示的氨基酸序列，發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有seq?id?no：28所示氨基酸序列的抗vegf抗體，其純度和產(chǎn)量均得到進(jìn)一步的提高。更驚奇的是，發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)所述抗體除了可以靶向vegf-c外，對vegf-d也具有明確的阻斷效果。此外，相比對照抗體，本發(fā)明所保護(hù)的抗體對vegf-c的促huvec細(xì)胞增殖活性的阻斷效果也更優(yōu)。

22、qvqllesggglvqpggslrlscaasgftfddyaigwfrqapgkgregvayissgegstyyadsvk?grftissdnskntvylqmnslraedtavyycaaglsvvlrklwaysfgydywgqgtlvtvssepksadkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqygstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq?id?no：28)

23、在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種多特異性抗體，包括：第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)，

24、所述第一結(jié)合區(qū)包含特異性結(jié)合vegf的單域抗體或其抗原結(jié)合片段，所述第二結(jié)合區(qū)包含特異性結(jié)合ang-2的單域抗體或其抗原結(jié)合片段；

25、所述的多特異性抗體還包含特異性結(jié)合vegf-a的vegf受體或其胞外結(jié)構(gòu)域片段。

26、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的特異性結(jié)合vegf的單域抗體或其抗原結(jié)合片段是靶向vegf-c和/或vegf-d。

27、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的多特異性抗體還包含至少一個(gè)連接肽；優(yōu)選地，所述的連接肽為gs連接肽。

28、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的多特異性抗體從n端到c端包含如式ia或ib所示的結(jié)構(gòu)：

29、p1-l1-p3-l2-p4-l3-p2(ia)；

30、p2-l3-p4-l2-p3-l1-p1(ib)；

31、其中，

32、p1為抗vegf單域抗體，

33、p2為抗ang-2單域抗體，

34、p3為igg的fc片段，

35、p4為結(jié)合vegf-a的vegf受體或其胞外結(jié)構(gòu)域，

36、l1、l2和l3各自獨(dú)立的為無或連接肽。

37、優(yōu)選地，所述的多特異性抗體從n端到c端具有如式ib所示的結(jié)構(gòu)。

38、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的抗vegf單域抗體為前述任一項(xiàng)所述的單域抗體。

39、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的抗ang-2單域抗體重鏈可變區(qū)包含hcdr1，hcdr2和hcdr3，其中：

40、hcdr1包含seq?id?no:18所示的序列，或者與seq?id?no:18具有至少80％同一性的氨基酸序列；

41、hcdr2包含seq?id?no:19或26所示的序列，或者與seq?id?no:19或26具有至少80％同一性的氨基酸序列；

42、hcdr3包含seq?id?no:20所示的序列，或者與seq?id?no:20具有至少80％同一性的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的抗ang-2單域抗體包含：

43、分別如seq?id?no:18、19和20或者與seq?id?no:18、19和20具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的hcdr1，hcdr2和hcdr3序列；或者

44、分別如seq?id?no:18、26和20或者與seq?id?no:18、26和20具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的hcdr1，hcdr2和hcdr3序列。

45、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的抗ang-2單域抗體包含如seq?id?no：21或23所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或與所述seq?id?no：21或23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

46、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的igg的fc片段為igg1?fc或其變體片段；任選地，所述的igg的fc片段具有seq?id?no：13所示的氨基酸序列，或與所述seq?id?no：13所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。任選地，所述的igg的fc片段包含如seq?id?no：30所示的氨基酸序列，或與所述seq?id?no：30所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

47、dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqygstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq?id?no：30)

48、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的vegf受體或其胞外結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no:27的氨基酸序列，或與所述seq?id?no:27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

49、sdtgrpfvemyseipeiihmtegrelvipcrvtspnitvtlkkfpldtlipdgkriiwdsrkgfiisnatykeiglltceatvnghlyktnylthrqtntiidvvlspshgielsvgeklvlnctartelnvgidfnweypsskhqhkklvnrdlktqsgsemkkflstltidgvtrsdqglytcaassglmtkknstfvrvhek(seq?id?no：27)

50、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的連接肽為gs連接肽，所述的連接肽序列為(g4s)n，其中，n為1、2、3、4、5或6，任選地，n為3。

51、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的多特異性抗體從n端到c端依次為抗ang-2單域抗體、gs連接肽、vegf胞外結(jié)構(gòu)域、igg的fc片段、gs連接肽、抗vegf單域抗體。

52、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的多特異性抗體包含seq?id?no:24的氨基酸序列，或與所述seq?id?no:24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

53、qvqllesggglvqpggslrlscaasgftfssfamswvrqapgkglewvsdinpegdntyyadsvkgrftisrdnskntv

54、ylqmnslraedtavyyctmgpgywgqgtlvtvssggggsggggsggggssdtgrpfvemyseipeiihmtegrelvipc

55、rvtspnitvtlkkfpldtlipdgkriiwdsrkgfiisnatykeiglltceatvnghlyktnylthrqtntiidvvlspshgiel

56、svgeklvlnctartelnvgidfnweypsskhqhkklvnrdlktqsgsemkkflstltidgvtrsdqglytcaassglmt

57、kknstfvrvhek

58、dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqygstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsqvqllesggglvqpggslrlscaasgftfddyaigwfrqapgkgregvayissgegstyyadsvkgrftissdnskntvylqmnslraedtavyycaaglsvvlrklwaysfgydywgqgtlvtvss(seqid?no：24)

59、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的多特異性抗體是對稱結(jié)構(gòu)，并包含兩條相同的肽鏈。

60、在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸分子編碼本發(fā)明第一方面所述的抗vegf的單域抗體，本發(fā)明第二方面所提出的抗vegf單域抗體的融合蛋白，或本發(fā)明第三方面所提出的多特異性抗體。

61、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述核酸分子還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征：

62、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸分子為dna。

63、在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述表達(dá)載體攜帶本發(fā)明第六方面所提出的核酸分子。

64、在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述重組細(xì)胞攜帶本發(fā)明第六方面所提出的核酸分子，或者本發(fā)明第七方面所提出的表達(dá)載體。

65、在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種免疫綴合物。所述的免疫綴合物包含本發(fā)明第一方面所述的抗vegf的單域抗體，本發(fā)明第二方面所提出的抗vegf單域抗體的融合蛋白，本發(fā)明第三方面所提出的多特異性抗體，本發(fā)明第四方面所提出的核酸分子，本發(fā)明第五方面所提出的表達(dá)載體或者本發(fā)明第六方面提出的重組細(xì)胞。

66、在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物含有本發(fā)明第一方面所述的抗vegf的單域抗體，本發(fā)明第二方面所提出的抗vegf單域抗體的融合蛋白，本發(fā)明第三方面所提出的多特異性抗體，本發(fā)明第四方面所提出的核酸分子，本發(fā)明第五方面所提出的表達(dá)載體，本發(fā)明第六方面提出的重組細(xì)胞或者本發(fā)明第七方面提出的免疫綴合物。

67、在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種前述單域抗體、融合蛋白、多特異性抗體、核酸分子、表達(dá)載體、重組細(xì)胞、免疫綴合物和/或藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者預(yù)防血管生成引起的相關(guān)眼部疾病。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用途，所述藥物用于治療脈絡(luò)膜血管新生(cnv)。

68、在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種檢測試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明前面所提出的單域抗體、融合蛋白或多特異性抗體。前面所述的抗vegf的單域抗體的試劑盒能夠特異性靶向結(jié)合vegf-c/d，實(shí)現(xiàn)vegf的特異性檢測，如當(dāng)抗體結(jié)合有熒光基團(tuán)時(shí)，可以采用熒光檢測裝置實(shí)現(xiàn)對vegf的定位或?qū)崟r(shí)檢測；當(dāng)抗體結(jié)合有生物素等標(biāo)記物時(shí)，可以通過顯色試劑顯色實(shí)現(xiàn)對vegf的定性或定量檢測；抗體也可以結(jié)合抗抗體，實(shí)現(xiàn)夾心或者雙夾心的方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)信號逐級放大，對vegf進(jìn)行檢測。前面所述的抗ang-2的單域抗體的試劑盒能夠特異性靶向結(jié)合ang-2，實(shí)現(xiàn)ang-2的特異性檢測，如當(dāng)抗體結(jié)合有熒光基團(tuán)時(shí)，可以采用熒光檢測裝置實(shí)現(xiàn)對ang-2的定位或?qū)崟r(shí)檢測；當(dāng)抗體結(jié)合有生物素等標(biāo)記物時(shí)，可以通過顯色試劑顯色實(shí)現(xiàn)對ang-2的定性或定量檢測；抗體也可以結(jié)合抗抗體，實(shí)現(xiàn)夾心或者雙夾心的方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)信號逐級放大，對ang-2進(jìn)行檢測。前面所述的抗vegf/ang-2的多特異性抗體的試劑盒能夠特異性靶向結(jié)合vegf-a/c/d和/或ang-2，實(shí)現(xiàn)vegf或/和ang-2的特異性檢測，如當(dāng)抗體結(jié)合有熒光基團(tuán)時(shí)，可以采用熒光檢測裝置實(shí)現(xiàn)對vegf或/和ang-2的定位或?qū)崟r(shí)檢測；當(dāng)抗體結(jié)合有生物素等標(biāo)記物時(shí)，可以通過顯色試劑顯色實(shí)現(xiàn)對vegf或/和ang-2的定性或定量檢測；抗體也可以結(jié)合抗抗體，實(shí)現(xiàn)夾心或者雙夾心的方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)信號逐級放大，對vegf或/和ang-2進(jìn)行檢測。

69、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。