本發(fā)明屬于生物，尤其涉及一種靶向ftsz和細(xì)胞膜的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、本部分的陳述僅僅是提供了與本發(fā)明相關(guān)的背景技術(shù)信息，不必然構(gòu)成在先技術(shù)。

2、抗生素的出現(xiàn)在人類發(fā)展過程中具有里程碑的意義，它極大提高了人們細(xì)菌感染的生存率，提高了人們的生活質(zhì)量。但隨著抗生素在各個領(lǐng)域的廣泛使用以及濫用，細(xì)菌耐藥性也不斷出現(xiàn)，耐藥性菌株感染對人類的威脅日益嚴(yán)重。因此除了要加強(qiáng)抗生素的監(jiān)管與使用，開發(fā)新型抗菌藥物亦迫在眉睫。

3、抗菌肽(amps)是一種小分子肽，在宿主對多種微生物(包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲和病毒)的先天免疫中起著至關(guān)重要的作用。長期以來，病原菌的治療主要依靠抗生素。然而，由于抗生素的單一靶點(diǎn)、長期和廣泛使用而產(chǎn)生的耐藥性正在成為臨床感染管理的主要挑戰(zhàn)。相比之下，amps通過作用于致病菌的質(zhì)膜上的多個靶點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)而顯示出優(yōu)勢，并且對耐藥菌具有強(qiáng)大的活性。因此，amps提供了一種新的抗生素替代品。然而，現(xiàn)有的amps在治療效果，滲透性、耐藥性等方面還存在挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種靶向ftsz和細(xì)胞膜的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了能夠靶向ftsz和細(xì)胞膜的抗菌肽，其序列如seq?id?no.1-8任一所示；本發(fā)明提供的抗菌肽能夠有效抑制多種細(xì)菌的生長，避免耐藥性，且具有較低的溶血性和細(xì)胞毒性，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個或多個實(shí)施例提供了如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種靶向ftsz和細(xì)胞膜的抗菌肽，所述抗菌肽具有如seqid?no.1-8任一所示的氨基酸序列。

4、細(xì)絲溫度敏感蛋白z(ftsz)始于細(xì)菌分裂起始調(diào)控過程開始，參與整個分裂過程的具有g(shù)tp酶活性的關(guān)鍵蛋白，可被視為一個非常有潛力的抗菌新靶點(diǎn)，而開發(fā)靶向于ftsz的新型抗菌藥物，來阻止細(xì)菌正常分裂，最終殺死細(xì)菌，不失為一種良好選擇。相比于小分子ftsz抑制劑種類數(shù)量繁多，相關(guān)多肽類抑制劑則報道較少。相對于傳統(tǒng)小分子化學(xué)藥物，多肽類藥物特異性較強(qiáng)，與受體的親和力較高，毒性較弱；相對于蛋白類大分子藥物，多肽類藥物易于合成修飾，質(zhì)量可控，免疫原性相對較小。因此，設(shè)計(jì)具有ftsz靶向性的多肽不失為一個良好的選擇。

5、sula蛋白是細(xì)菌sos反應(yīng)(dna損傷的情況下抑制細(xì)胞分裂和修復(fù)dna的機(jī)制)時被誘導(dǎo)表達(dá)出來的一種蛋白。sula蛋白通過形成二聚體，與ftsz蛋白t7-loop表面相結(jié)合，阻斷ftsz聚合來阻斷z環(huán)的形成，從而抑制細(xì)菌分裂。因此，本發(fā)明從sula蛋白中截取活性片段設(shè)計(jì)合成既靶向ftsz蛋白又具有抗菌肽性質(zhì)的多肽，源自細(xì)菌內(nèi)源性蛋白sula，通過計(jì)算機(jī)計(jì)算sula與ftsz結(jié)合表面氨基酸結(jié)合自由能、相互作用力，并截取片段進(jìn)行對接打分和分子動力學(xué)模擬最終獲得，氨基酸序列為如seq?id?no.8所示?；谙葘?dǎo)肽sula(88-106)，通過改變其凈電荷、α-螺旋度、疏水性、兩親性以提高其細(xì)胞膜作用，得到衍生肽a-1、a-2、a-3、a-4、a-5、b-1和b-2其命名和氨基酸序列如下：

6、a-1：thrwlrraglnrrrilllq(seq?id?no.1)，a-2：thrwlrraglnrerilllq(seq?idno.2)，a-3：thrwlrrlllnrrrilllq(seq?id?no.3)，a-4：thrwlrriilnrrrilllq(seq?idno.4)a-5：thrwlrriilnrerilllq(seq?id?no.5)，b-1：thrwlrrllrnrrrilrlq(seq?idno.6)，b-2：thrwlrriirnrrrilrlq(seq?id?no.7)，sula：thewlrraglnrerilllq(seq?idno.8)。

7、所述抗菌肽氨基酸序列具有與seq?id?no.1-8相比至少80％的同源性；更優(yōu)選地，具有至少90％的同源性；最優(yōu)選地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

8、第二方面，本發(fā)明提供一種綴合物，所述綴合物包括第一方面所述抗菌肽和修飾部分；

9、所述修飾部分任選地通過接頭連接至所述抗菌肽的n端或c端；

10、所述修飾部分包括靶向部分、熒光染料及蛋白標(biāo)簽；

11、所述靶向部分是配體、受體或抗體；

12、所述熒光染料為fitc；

13、所述蛋白標(biāo)簽為his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp或生物素。

14、第三方面，本發(fā)明提供一種編碼第一方面所述抗菌肽或第二方面所述綴合物的核酸。

15、第三方面，本發(fā)明提供含有第一方面所述抗菌肽或第二方面所述綴合物的廣譜抗菌藥物或組合物。

16、在本發(fā)明的一個或多個具體實(shí)施方式中，所述組合物中還可以包括其他抗菌藥，其中，所述其他抗菌藥包括青霉素類抗生素、頭孢類抗生素、紅霉素類抗生素、四環(huán)素類抗生素、氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和/或多肽類抗生素；

17、或，所述廣譜抗菌藥物或組合物中包括藥學(xué)上可接受的輔料；

18、所述藥學(xué)上可接受的輔料包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑及稀釋劑。

19、在本發(fā)明的一個或多個具體實(shí)施方式中，所述藥物為內(nèi)用藥物或外用藥物；所述內(nèi)用藥物為口服制劑或注射劑；所述外用藥物包括貼劑及涂抹制劑。

20、第四方面，本發(fā)明提供含有第一方面所述抗菌肽或第二方面所述綴合物的殺菌劑。

21、第五方面，本發(fā)明提供第一方面所述抗菌肽的制備方法，將中間體fmoc-s、fmoc-a1、fmoc-a2、fmoc-b1或fmoc-b2分別與等比例的boc-a偶聯(lián)到中間體tag-a、tag-s或tag-b上得到tag-全保護(hù)多肽，脫除tag-oh載體和氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基后得抗菌肽；

22、所述boc-a與中間體tag-a、tag-s或tag-b的濃度比為1-2:1。

23、在本發(fā)明的一個或多個具體實(shí)施方式中，所述fmoc-s與boc-a偶聯(lián)到中間體tag-a上經(jīng)處理后獲得抗菌肽a-1；

24、所述fmoc-s與boc-a偶聯(lián)到中間體tag-s上經(jīng)處理后獲得抗菌肽a-2；

25、所述fmoc-a1與boc-a偶聯(lián)到中間體tag-a上經(jīng)處理后獲得抗菌肽a-3

26、所述fmoc-a2與boc-a偶聯(lián)到中間體tag-a上經(jīng)處理后獲得抗菌肽a-4；

27、所述fmoc-a1與boc-a偶聯(lián)到中間體tag-s上經(jīng)處理后獲得抗菌肽a-5；

28、所述fmoc-b1與boc-a偶聯(lián)到中間體tag-b上經(jīng)處理后獲得抗菌肽b-1；

29、所述fmoc-b2與boc-a偶聯(lián)到中間體tag-b上經(jīng)處理后獲得抗菌肽b-2。在本發(fā)明的一個或多個具體實(shí)施方式中，使用多肽液相合成法分片段合成多肽，使用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，得到所述抗菌肽。

30、所用基礎(chǔ)片段結(jié)構(gòu)及序列如下：

31、片段tag-s結(jié)構(gòu)：glu(tbu)-arg(pbf)-ile-leu-leu-leu-gln(trt)-o-tag，

32、片段fmoc-s結(jié)構(gòu)：fmoc-arg(pbf)-ala-gly-leu-asn(trt)-arg(pbf)-oh，

33、片段boc-s結(jié)構(gòu)：boc-thr(tbu)-his(trt)-glu(tbu)-trp(boc)-leu-arg(pbf)-oh，

34、片段tag-a結(jié)構(gòu)：arg(pbf)-arg(pbf)-ile-leu-leu-leu-gln(trt)-o-tag，

35、片段tag-b結(jié)構(gòu)：arg(pbf)-arg(pbf)-ile-leu-arg(pbf)-leu-gln(trt)-o-tag，

36、片段fmoc-a1結(jié)構(gòu)：fmoc-arg(pbf)-leu-leu-leu-asn(trt)-arg(pbf)-oh，

37、片段fmoc-a2結(jié)構(gòu)：fmoc-arg(pbf)-ile-ile-leu-asn(trt)-arg(pbf)-oh，

38、片段fmoc-b1結(jié)構(gòu)：fmoc-arg(pbf)-leu-leu-arg(pbf)-asn(trt)-arg(pbf)-oh，

39、片段fmoc-b2結(jié)構(gòu)：fmoc-arg(pbf)-ile-ile-arg(pbf)-asn(trt)-arg(pbf)-oh，

40、片段boc-a結(jié)構(gòu)：boc-thr(tbu)-his(trt)-arg(pbf)-trp(boc)-leu-arg(pbf)-oh。

41、第六方面，本發(fā)明提供第一方面所述抗菌肽或第五方面所述的方法在如下任一一種或多種中的應(yīng)用：

42、y1：制備廣譜抗菌藥物或組合物；

43、y2：制備殺菌劑；

44、y3：制備消毒劑、洗滌劑、防腐劑或飼料添加劑；

45、y4：制備ftsz蛋白的靶向肽或靶向化合物。

46、在本發(fā)明的一個或多個具體實(shí)施方式中，所述菌包括革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌；

47、優(yōu)選的，菌包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、釀膿鏈球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌或鮑曼不動桿菌中的一種或多種。

48、在本發(fā)明的一個或多個具體實(shí)施方式中，當(dāng)抗菌肽為a-1(seq?id?no.1)時，所述菌包括短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌中或鮑曼不動桿菌的一種或多種；

49、當(dāng)抗菌肽為a-2(seq?id?no.2)時，所述菌包括短小芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌或金黃色葡萄球菌中的一種或多種；

50、當(dāng)抗菌肽為a-3(seq?id?no.3)時，所述菌包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌或化膿鏈球菌中的一種或多種；

51、當(dāng)抗菌肽為a-4(seq?id?no.4)時，所述菌包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌或化膿鏈球菌中的一種或多種；

52、當(dāng)抗菌肽為a-5(seq?id?no.5)時，所述菌包括短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌或化膿鏈球菌中的一種或多種；

53、當(dāng)抗菌肽為b-1(seq?id?no.6)時，所述菌包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌或化膿鏈球菌中的一種或多種；

54、當(dāng)抗菌肽為b-2(seq?id?no.7)時，所述菌包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌或化膿鏈球菌中的一種或多種；

55、當(dāng)抗菌肽為sula(seq?id?no.1)時，所述菌包括枯草芽孢桿菌黑色變種、表皮葡萄球菌或短小芽孢桿菌中的一種或多種。

56、第七方面，本發(fā)明提供一種靶向ftsz蛋白的靶向肽，含有seq?id?no.1-8任一所示的氨基酸序列。

57、需要說明的是，本發(fā)明中公開的seq?id?no.1-8具有靶向ftsz蛋白的功能，所以，因包含以上序列實(shí)現(xiàn)靶向功能的脂質(zhì)體、囊泡、外泌體或細(xì)胞等均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)；同時含有以上序列的ftsz抗體同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

58、以上一個或多個技術(shù)方案存在以下有益效果：

59、(1)本發(fā)明的抗菌肽源自細(xì)菌內(nèi)源性蛋白sula，通過計(jì)算機(jī)計(jì)算其于ftsz結(jié)合表面氨基酸結(jié)合自由能、相互作用力，并截取片段進(jìn)行對接打分和分子動力學(xué)模擬，獲得先導(dǎo)化合物sula(88-106)，并進(jìn)行修飾得到一系列衍生肽，其中b-1通過靶向ftsz和細(xì)胞膜雙作用機(jī)制發(fā)揮較好的廣譜抗菌活性，為雙靶點(diǎn)抗菌肽的研究提供了新思路。

60、(2)本發(fā)明的抗菌肽經(jīng)過體外和體內(nèi)抗菌性能、靶向性測定及溶血毒性相關(guān)實(shí)驗(yàn)，證明其具有對革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌的廣譜抗菌活性，能夠高效靶向ftsz和細(xì)胞膜，同時，具較低的溶血性和細(xì)胞毒性，安全性較好，適宜臨床應(yīng)用。

61、(3)抗菌肽由19個氨基酸組成，制備方法和技術(shù)成熟，合成成本低。

62、本發(fā)明附加方面的優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。