本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及水稻核黃素合成酶基因osribab2及其負(fù)調(diào)控耐鹽和耐旱性的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、

2、作為固著生物，植物必須適應(yīng)土壤鹽堿害、干旱以及極端溫度等非生物脅迫。鹽主要引起植物遭受滲透脅迫和離子毒害，而干旱則主要使植物遭受滲透脅迫。二者對(duì)植物帶來(lái)的次級(jí)影響較為復(fù)雜，包括導(dǎo)致氧化損傷、破壞膜脂、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞組分，并引起代謝紊亂。

3、土壤中鹽分濃度的增加不僅會(huì)減少水分吸收，還會(huì)導(dǎo)致水稻吸收大量的na+和cl-，從而導(dǎo)致滲透和離子脅迫(deinlein,et?al.plant?salt-tolerance?mechanisms.trendsplant?sci.2014,19,371–379)。水稻減少水分流失，同時(shí)最大限度地吸收水分，以緩解滲透脅迫。通過(guò)積累調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)來(lái)降低細(xì)胞質(zhì)水勢(shì)是保護(hù)水稻免受鹽脅迫的基本策略(reddy,et?al.salt?tolerance?in?rice:focus?on?mechanisms?and?approaches.ricesci.2017,24,123–144)。在高鹽條件下，水稻可快速誘導(dǎo)編碼調(diào)滲物質(zhì)產(chǎn)生酶的基因，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)積累，水勢(shì)下降，從而增強(qiáng)水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性(li,etal.overexpression?of?the?trehalose-6-phosphate?synthase?gene?ostps1?enhancesabiotic?stress?tolerance?in?rice.planta,2011,234,1007–1018)。另外，水稻通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)體控制根系和莖部細(xì)胞的質(zhì)膜和液泡膜對(duì)na+的凈攝取，以減少細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的離子毒性，其中最經(jīng)典的一個(gè)通路就是sos(salt-overly-sensitivity)途徑。sos途徑最開始在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在水稻中被證明存在同樣的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控鹽脅迫耐受性。該途徑主要由sos1、sos2和sos3為核心組成，通過(guò)響應(yīng)ca2+和磷酸化修飾來(lái)調(diào)控k+和na+的轉(zhuǎn)運(yùn)(martinez-atienza,et?al.conservation?of?the?salt?overly?sensitive?pathway?inrice.plant?physiol.2007,143,1001–1012)。

4、干旱脅迫的一個(gè)標(biāo)志是脫落酸(aba)的積累，它引起了幾種保護(hù)性反應(yīng)，包括氣孔的關(guān)閉和脅迫應(yīng)答基因的誘導(dǎo)(caine,et?al.rice?with?reduced?stomatal?densityconserves?water?and?has?improved?drought?tolerance?under?future?climateconditions.new?phytol.2019,221,371–384)。許多證據(jù)表明氣孔的打開和關(guān)閉與植物耐旱密切關(guān)聯(lián)：在水分充足的條件下，氣孔對(duì)光的響應(yīng)使co2進(jìn)入葉片進(jìn)行光合作用，水分通過(guò)蒸騰作用蒸發(fā)，從而調(diào)節(jié)葉片溫度；在缺水干旱條件下，氣孔關(guān)閉以減緩水分流失，從而提高生存和水分利用效率(chen,et?al.protein?kinases?in?plant?responses?todrought,salt,and?cold?stress.j.integr.plant?biol.2021,63,53–78)。aba在干旱脅迫下調(diào)節(jié)植物氣孔運(yùn)動(dòng)以減少蒸騰作用中起著關(guān)鍵作用，因此許多關(guān)于干旱脅迫的研究都集中在aba信號(hào)傳導(dǎo)上，尤其是對(duì)aba受體的研究。pyr1和pyl蛋白家族在擬南芥和水稻中作為aba受體發(fā)揮作用，ospyl1、ospyl6和ospyl12組合突變使水稻不耐旱(miao,etal.mutations?in?a?subfamily?of?abscisic?acid?receptor?genes?promote?ricegrowth?and?productivity.proc.natl.acad.sci.usa.2018,115,6058–6063)；過(guò)表達(dá)ospyl3、ospyl5、ospyl9和ospyl11使水稻耐旱(kim,et?al.overexpression?ofpyl5?inrice?enhances?drought?tolerance,inhibits?growth,and?modulates?geneexpression.j.exp?bot.2014,65,453–464；tian,et?al.characterization?andfunctional?analysis?of?pyrabactin?resistance-like?abscisic?acid?receptorfamily?in?rice.rice,2015,8,28)。除aba外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，h2o2在干旱脅迫下水稻氣孔關(guān)閉中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用方式包括aba依賴和aba不依賴。osasr5就是通過(guò)與aba和h2o2信號(hào)相關(guān)的氣孔關(guān)閉途徑促進(jìn)干旱耐受性(li,et?al.osasr5?enhances?droughttolerance?through?a?stomatal?closure?pathway?associated?with?abaandh2o2signalling?in?rice.plant?biotechnol.j.2017,15,183–196)，而dst和ossro1則只通過(guò)調(diào)節(jié)h2o2的積累來(lái)調(diào)控水稻氣孔閉合，而不依賴于aba(you,et?al.the?snac1-targetedgene?ossro1c?modulates?stomatal?closure?and?oxidative?stress?tolerance?byregulating?hydrogen?peroxide?in?rice.j.exp.bot.2013,64,569–583)。

5、核黃素(riboflavin)的從頭合成存在于植物、真菌、古細(xì)菌和眾多細(xì)菌中，而動(dòng)物則依賴于飲食供應(yīng)(bacher,et?al.biosynthesis?of?vitamin?b2(riboflavin).annu.rev.nutr.2000,20:153-167)。核黃素是黃素單核苷酸(fmn)和黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)的合成前體，黃素單核苷酸(fmn)和黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)是參與單電子和雙電子氧化還原過(guò)程的多種酶(如脫氫酶、氧化酶、還原酶)的必需輔因子。對(duì)于所有生物中的主要代謝途徑至關(guān)重要。在植物中，這些輔因子是光合作用、線粒體電子運(yùn)輸、脂肪酸氧化、光接收、dna修復(fù)、其他輔因子的代謝以及許多次生代謝產(chǎn)物生物合成所必需的(fischer?andbacher.biosynthesis?of?vitamin?b2:structure?and?mechanism?of?riboflavin?synthase.arch.biochem.biophys.2008,474:252-265；ouyang,et?al.the?photosensitivephs1?mutant?is?impaired?in?the?riboflavin?biogenesis?pathway.j.plantphysiol.2010,167:1466-1476)。核黃素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用已有報(bào)道，比如核黃素能保護(hù)植物避免光氧化損傷(hedtke,et?al.deficiency?in?riboflavin?biosynthesisaffects?tetrapyrrole?biosynthesis?in?etiolated?arabidopsis?tissue.plantmol.biol.2012,78,77–93)、能維持活性氧的平衡和葉綠體的正常發(fā)育(hu,et?al.whiteand?lesion-mimic?leaf1,encoding?a?lumazine?synthase,affects?reactive?oxygenspecies?balance?and?chloroplast?development?in?rice.plant?j.2021,108:1690-1703)，以及協(xié)同線粒體能量代謝和細(xì)胞周期來(lái)調(diào)控胚乳發(fā)育(tian,et?al.riboflavinintegrates?cellular?energetics?and?cell?cycle?to?regulate?maize?seeddevelopment.plant?biotechnol.j.2022,20:1487-1501)。

6、盡管核黃素在植物生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于其在非生物脅迫中的作用卻知之甚少。前期我們通過(guò)圖位克隆技術(shù)，從響應(yīng)高溫的水稻分蘗突變體tsm1中鑒定到核黃素合成關(guān)鍵酶基因osribab2(周正琨.高溫寡分蘗水稻突變體tsm1的基因定位與功能分析.湖南大學(xué),2021)。我們最近發(fā)現(xiàn)，osribab2編碼蛋白具有2個(gè)酶活性結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是位于n端的3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(dhbps)活性域；另一個(gè)是位于c端的gtp環(huán)化水解酶ii(gchii)活性域。osribab2中的2個(gè)結(jié)構(gòu)域的酶活性控制著生物體內(nèi)核黃素合成途徑的關(guān)鍵起始反應(yīng)。其部分功能缺失(gchii缺失)突變體tsm1顯著提高了水稻耐鹽性和耐旱性。因此，可以通過(guò)生物技術(shù)利用osribab2培育耐鹽性和耐旱性改良的水稻材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種水稻核黃素合成酶蛋白編碼基因osribab2，該基因負(fù)調(diào)控水稻的耐鹽性和耐旱性。鹽和干旱處理后，osribab2部分功能缺失(gchii缺失)的tsm1植株體內(nèi)超氧化物岐化酶(sod)、過(guò)氧化氫酶(cat)的酶活性均要高于野生型(wt)，體內(nèi)最終的過(guò)氧化氫(h2o2)含量要顯著低于wt，其它一些與耐逆正相關(guān)的指標(biāo)如脯氨酸、可溶性糖以及葉綠素的含量均要高于wt，而與耐逆負(fù)相關(guān)的指標(biāo)如丙二醛(mda)含量和相對(duì)離子滲透率均要低于wt。這些結(jié)果表明osribab2基因在水稻耐鹽和耐旱品種培育具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明中負(fù)調(diào)控水稻耐鹽和耐旱性的基因osribab2為培育耐鹽和耐旱水稻方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2、本發(fā)明所提供的水稻核黃素合成酶蛋白，名稱為osribab2，來(lái)源于水稻(oryzasativa?l.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)：

3、1)序列表中的seq?id?no:3；

4、2)將序列表中seq?id?no:3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)1-10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控水稻耐鹽和耐旱功能的蛋白質(zhì)。

5、序列表中的序列3由554個(gè)氨基酸殘基組成。

6、osribab2的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

7、osribab2基因的cdna，可具有下述核苷酸序列之一：

8、1)序列表中seq?id?no:2的dna序列；

9、2)編碼序列表中seq?id?no:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；

10、3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中seq?id?no:2限定的dna序列雜交的核苷酸序列；

11、4)與序列表中seq?id?no:2限定的dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列。

12、序列表中的序列2由1,662個(gè)堿基組成，其開放閱讀框(orf)為自5′端第1位至1,662位堿基。

13、osribab2的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一：

14、1)序列表中seq?id?no:1的dna序列；

15、2)編碼序列表中seq?id?no:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；

16、3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中seq?id?no:1限定的dna序列雜交的核苷酸序列；

17、4)與序列表中seq?id?no:1限定的dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列。

18、序列表中的序列1為osribab2的基因組序列，包含了4,949個(gè)堿基，該基因含有7個(gè)外顯子(序列1的5′端起：419～472，871～1266，1353～1575，2261～2582，3039～3169，3280～3575，4320～4559)和6個(gè)內(nèi)含子(序列1的5′端起：473～870，1267～1352，1576～2260，2583～3038，3170～3279，3576～4319)。

19、所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×sspe(或0.1×ss)，0.1×sds的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。

20、含有osribab2的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

21、擴(kuò)增osribab2基因中任一片段的引物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

22、本發(fā)明提供所述水稻核黃素合成酶編碼基因在培育水稻品種中的應(yīng)用。具體地，培育耐鹽和/或耐旱的水稻品種。

23、進(jìn)一步地，通過(guò)基因工程手段將水稻內(nèi)源的osribab2基因發(fā)生部分功能缺失突變或全部功能喪失的突變。

24、更具體地，所述基因工程手段是基因敲除或基因沉默的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，具體是基因編輯的方法或rnai技術(shù)。

25、進(jìn)一步具體地，所述基因編輯的方法或rnai技術(shù)是針對(duì)水稻核黃素合成酶編碼基因中的15個(gè)或15個(gè)以上連續(xù)堿基的寡核苷酸作為靶標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)sgrna或sirna，使基因功能失活，從而使轉(zhuǎn)基因水稻具有耐鹽性和耐旱性。

26、本發(fā)明具有以下有益效果：

27、osribab2在水稻鹽和干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，負(fù)調(diào)控水稻耐鹽性和耐旱性。實(shí)驗(yàn)證明，140mm?nacl和20％peg處理下，osribab2部分功能缺失(gchii缺失)的tsm1突變植株體內(nèi)sod、cat的酶活性均要高于wt，體內(nèi)最終的h2o2含量要顯著低于wt，其它一些與耐逆正相關(guān)的指標(biāo)如脯氨酸、可溶性糖以及葉綠素的含量均要高于wt，而與耐逆負(fù)相關(guān)的指標(biāo)如丙二醛(mda)含量和相對(duì)離子滲透率均要低于wt。這些結(jié)果表明，當(dāng)osribab2的gchii酶活性域發(fā)生突變后，水稻體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)活性會(huì)提高并且清除ros的能力增強(qiáng)，從而提高水稻的耐鹽性和耐旱性。后續(xù)可以通過(guò)基因敲除或基因沉默的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，利用osribab2基因可以對(duì)水稻的耐鹽性以及耐旱性進(jìn)行遺傳改良，在農(nóng)業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

28、下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明