本發(fā)明屬于水環(huán)境檢測，具體涉及一種污水中病原細(xì)菌檢測用磁性納米酶顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、國標(biāo)中對污水處理廠排出水中的細(xì)菌濃度具有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)的污水樣本中病原體檢測方法主要是核酸分子檢測定量法。但是該方法需要操作復(fù)雜的儀器，潔凈的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，具有專業(yè)知識基礎(chǔ)的操作人員，因此無法進(jìn)行現(xiàn)場檢測，對出水口的水質(zhì)進(jìn)行快速判斷。

2、現(xiàn)階段利用有機(jī)金屬框架材料制作的生物傳感器對細(xì)菌濃度檢測的專利數(shù)量較少。有一篇專利cn111150876a：耐藥性可視化的創(chuàng)可貼及其制備方法，針對的是人體組織表面細(xì)菌檢測場景，且只能進(jìn)行非特異性地定性檢測。

3、對大體積環(huán)境樣本中的細(xì)菌濃度進(jìn)行核酸檢測需要操作復(fù)雜的儀器，潔凈的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，具有專業(yè)知識基礎(chǔ)的操作人員，使核酸檢測難于進(jìn)行現(xiàn)場及時(shí)檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種對環(huán)境水體病原中細(xì)菌進(jìn)行現(xiàn)場高效富集及檢測的磁性納米酶顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供的環(huán)境水體病原中細(xì)菌檢測用磁性納米酶顆粒，包括具有磁性的zif-8金屬有機(jī)框架多孔納米材料、辣根過氧化物酶；其中：

3、所述磁性zif-8金屬有機(jī)框架多孔納米材料，是以硫酸亞鐵、乙酸鋅、二甲基咪唑作為前體物合成、粒徑為25–100nm的球形磁性納米顆粒；該磁性納米顆粒具有介孔結(jié)構(gòu)，孔徑為2–30nm；磁性納米顆粒表面整體帶正電；

4、所述辣根過氧化物酶，是將其添加到合成zif-8的前體溶液中；因?yàn)殪o電吸引作用，在酶表面附近的前體物質(zhì)濃度較高，金屬有機(jī)框架多孔納米材料聚集在辣根過氧化物酶表面，形成辣根過氧化物酶為核的磁性多孔納米酶。

5、本發(fā)明提供的磁性納米酶顆粒的制備方法，具體步驟如下：

6、準(zhǔn)備二甲基咪唑和辣根過氧化物酶混合水溶液，稱為a液；準(zhǔn)備乙酸鋅和硫酸鐵水溶液，稱為b液；將b液注入a液中，室溫?cái)嚢?，之后室溫靜置反應(yīng)；其中，硫酸亞鐵、乙酸鋅、二甲基咪唑反應(yīng)，得到zif-8磁性金屬有機(jī)框架多孔納米材料，其粒徑為25–100nm，介孔孔徑為2–30nm，顆粒表面整體帶正電；由于靜電吸引作用，在辣根過氧化物酶表面附近的前體物質(zhì)濃度較高，金屬有機(jī)框架多孔納米材料聚集在辣根過氧化物酶表面，形成辣根過氧化物酶為核的磁性多孔納米酶；經(jīng)過去離子水清洗后，得到球狀、表面粗糙的磁性納米酶顆粒材料。

7、其中：

8、所述二甲基咪唑溶液摩爾濃度為30–3000mm；

9、所述乙酸鋅溶液摩爾濃度為10–1000mm；

10、所述硫酸亞鐵溶液摩爾濃度為10–1000mm；

11、所述辣根過氧化物酶溶液質(zhì)量濃度為2.5ng/ml–2.5g/ml；

12、所述攪拌時(shí)間為5–120min；

13、所述靜置時(shí)間為1–48h。

14、本發(fā)明還提供適配體封裝的熒光磁性納米酶顆粒在特異性免疫檢測細(xì)菌濃度中的應(yīng)用。具體地，包括：(一)利用顆粒多孔性的特性，具有特異性的病原菌免疫熒光檢測法；(二)利用顆粒過氧化物酶催化特性，結(jié)合葡萄糖氧化酶搭建酶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，提出檢測總細(xì)菌濃度的便攜性比色法，用于廣譜性的測試水體中病原菌菌群濃度。具體地：

15、(一)所述利用顆粒多孔特性，進(jìn)行特異性的病原菌免疫熒光檢測，具體步驟如下：

16、選擇能特異性識別目標(biāo)細(xì)菌的核酸適配體、小分子有機(jī)熒光染料；熒光染料通過自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入磁性納米酶的內(nèi)部孔道；引入具有“門”作用的適配體將孔道封住，防止熒光染料從多孔磁性納米酶中擴(kuò)散出來；當(dāng)適配體與目標(biāo)細(xì)菌結(jié)合之后，適配體的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生卷曲，孔道打開，熒光染料擴(kuò)散入上清液中；通過檢測上清液中熒光的發(fā)射強(qiáng)度，即可以表征樣品中目標(biāo)細(xì)菌的濃度。具體步驟如下：

17、(1)取適量磁性納米酶顆粒與熒光染料水溶液靜置反應(yīng)；去離子水清洗1次；將熒光磁性納米顆粒加入核酸適配體溶液中，靜置反應(yīng)；去離子水清洗1次；

18、(2)取適量上述適配體封裝熒光磁性納米酶顆粒與含有目標(biāo)細(xì)菌的樣本反應(yīng)，測量上清液中熒光染料的發(fā)射強(qiáng)度。

19、其中：

20、所述磁性納米酶顆粒的質(zhì)量濃度為1μg/ml–1g/ml；

21、所述熒光染料的摩爾濃度為1nm–1m；

22、所述兩次靜置反應(yīng)時(shí)間為5min–48h；

23、所述核酸適配體濃度為1pm–1mm；

24、所述適配體封裝熒光磁性納米酶顆粒使用量為1ng–1mg；

25、所述與目標(biāo)細(xì)菌的反應(yīng)時(shí)間為1min–12h。

26、(二)利用顆粒過氧化物酶催化特性，結(jié)合葡萄糖氧化酶搭建酶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)行總細(xì)菌濃度的便攜性比色檢測，具體采用peg-gox修飾磁性納米酶顆粒；peg-gox修飾的磁性納米酶顆粒與目標(biāo)細(xì)菌混合反應(yīng)后，因?yàn)榧?xì)菌表面帶有的負(fù)電荷比peg-gox更多，所以磁性納米酶與細(xì)菌的親和能力更強(qiáng)，peg-gox從磁性納米酶顆粒表面解吸；使用葡萄糖和tmb作為反應(yīng)前體物可以通過比色法表征樣品中細(xì)菌的總濃度。具體步驟如下：

27、(1)首先制備peg修飾的gox；

28、磁性納米酶顆粒再與peg-gox孵育反應(yīng)，peg-gox通過靜電吸附附著在磁性納米酶顆粒表面，用去離子水清洗1次；

29、(2)使用peg-gox修飾的磁性納米酶顆粒，檢測水體中病原細(xì)菌濃度的：

30、取適量peg-gox修飾磁性納米酶顆粒與含有細(xì)菌的樣本室溫反應(yīng)，去除上清液，向沉淀中加入用乙酸鈉緩沖液溶解的tmb和葡萄糖混合溶液，比色反應(yīng)一段時(shí)間后，測量上清液中特定波段紫外吸收峰值。

31、其中：

32、所述修飾gox的peg分子量為100–7×106；

33、所述gox濃度為1ng/ml–10g/ml；

34、所述孵育反應(yīng)時(shí)間為5min–48h。

35、所述peg-gox修飾磁性納米酶顆粒與細(xì)菌溶液反應(yīng)時(shí)間為1min–12h；

36、所述乙酸鈉緩沖液濃度為1mm–1m；ph值為2–7；

37、所述tmb濃度為10μm–100mm；

38、所述葡萄糖濃度為10μm–100mm；

39、所述比色反應(yīng)時(shí)間為5min–30min。

40、綜上，本發(fā)明首次合成了一種制備工藝簡單、可重復(fù)性高、成本低廉的磁性(有機(jī)金屬框架材料—辣根過氧化物)納米顆粒。這種磁性納米酶顆?？梢詮拇篌w積污水樣本中快速富集病原菌至顆粒表面，相比于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的peg沉淀法或者膜過濾法，具有成本低廉、快速高效的特點(diǎn)。基于磁性納米酶顆粒廣譜性富集細(xì)菌的特性，本發(fā)明進(jìn)一步利用顆粒多孔性的特性，提供了具有特異性的病原菌免疫熒光檢測法；同時(shí)本發(fā)明利用顆粒過氧化物酶催化特性，結(jié)合葡萄糖氧化酶搭建酶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，提出了檢測總細(xì)菌濃度的便攜性比色法，用于廣譜性的測試水體中病原菌菌群濃度。

41、與以往技術(shù)相比的有益效果

42、環(huán)境水體樣本病原菌濃度低于核酸擴(kuò)增法的檢測限，因此耗時(shí)、成本高的病菌富集和核酸提取過程是利用核酸擴(kuò)增檢測大體積污水中病原菌不能缺少的過程，并且核酸檢測法需要干凈的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，無法在現(xiàn)場實(shí)時(shí)監(jiān)測。本發(fā)明中磁性納米酶顆粒具有順磁性、廣譜性富集細(xì)菌能力、多孔性、過氧化物酶活性的特點(diǎn)。本發(fā)明填補(bǔ)了大體積污水樣本中病原菌濃度現(xiàn)場檢測這一場景的產(chǎn)品空缺。