本發(fā)明屬于生物，特別涉及一株枯草芽孢桿菌及其在提取化橘紅樹葉柚皮苷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、柚皮苷是由4,5,7-三羥基二氫黃酮苷元與鼠李糖苷[2-o-(6-脫氧-α-l-甘露聚糖)-β-d-葡萄糖]構(gòu)成的化合物，廣泛存在于柚子皮中，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)糖和脂代謝等生理功能。在醫(yī)藥和功能食品領(lǐng)域，柚皮苷通常是止咳化痰、防治糖尿病、防止骨質(zhì)疏松、防治腫瘤的重要原料。

2、化橘紅為化州柚的未成熟或接近成熟的外層果皮，富含柚皮苷以及其它黃酮化合物，是廣東省“十大珍稀中藥材”之一。近年來，化橘紅的研究與應(yīng)用備受人們關(guān)注，逐漸成為藥膳、中成藥和保健食品的重要原料。但是，化橘紅果實(shí)一年只收成一次，其產(chǎn)量受生長周期限制。除了化橘紅果含有柚皮苷以外，化橘紅樹葉也富含柚皮苷以及多種黃酮化合物，其資源豐富，是常年制取柚皮苷的重要來源，但是關(guān)于這方面的研究極少。開發(fā)一種從化橘紅樹葉有效提取柚皮苷方法，有利于推動(dòng)化橘紅樹葉資源的高附加值開發(fā)利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一株枯草芽孢桿菌及其在提取化橘紅樹葉柚皮苷中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種微生物輔助發(fā)酵化橘紅樹葉制備富含柚皮苷提取物的方法。

3、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一株枯草芽孢桿菌，名稱為枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)jh03，保藏編號(hào)為gdmcc?no：64470，于2024年3月29日保藏于位于廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓廣東省科學(xué)院微生物研究所的廣東省微生物菌種保藏中心。

4、上述枯草芽孢桿菌在提取化橘紅樹葉柚皮苷中的應(yīng)用，是利用上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵化橘紅樹葉，促進(jìn)其中的黃酮化合物轉(zhuǎn)化為柚皮苷，從而提高柚皮苷的含量。

5、一種微生物輔助發(fā)酵化橘紅樹葉制備富含柚皮苷提取物的方法，包括如下步驟：

6、(1)化橘紅樹葉發(fā)酵：將新鮮的化橘紅樹葉清洗干凈，與水混合，加入蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀，經(jīng)勻漿后滅菌，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；冷卻后接入枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，發(fā)酵，得到發(fā)酵物料；

7、(2)發(fā)酵液上清液的制備及處理：煮沸發(fā)酵物料，對發(fā)酵物料進(jìn)行勻漿，經(jīng)離心分離，獲得上清液；在上清液中加入乙酸乙酯，充分振蕩混合，靜置分層，收集水層液體，繼續(xù)后續(xù)操作；

8、(3)第一次大孔樹脂柱的分離處理：先用大孔樹脂柱對處理后的上清液進(jìn)行吸附處理，再用水進(jìn)行洗柱操作，然后用甲醇對大孔樹脂柱進(jìn)行解吸操作，收集解吸液；

9、(4)第一次蒸發(fā)濃縮與結(jié)晶：將步驟(3)得到的解吸液加入水混合，采用蒸餾法對得到的混合溶液進(jìn)行濃縮，再將濃縮液進(jìn)行結(jié)晶操作，離心分離獲得濕固體沉淀物；

10、(5)第二次大孔樹脂柱的分離處理：將步驟(4)得到的濕固體沉淀物溶于堿性的水中，再次上柱進(jìn)行吸附處理，再用水進(jìn)行洗柱操作，然后用甲醇溶液對大孔樹脂柱進(jìn)行解吸操作，收集解吸液；

11、(6)第二次蒸發(fā)濃縮與結(jié)晶：將步驟(5)得到的解吸液加入水，采用蒸餾法對得到的混合溶液進(jìn)行濃縮，再將濃縮液進(jìn)行結(jié)晶操作，離心分離獲得固體沉淀物，將得到的固體沉淀物烘干，即得柚皮苷固體提取物。

12、步驟(1)中：

13、所述的化橘紅樹葉與所述的水優(yōu)選按質(zhì)量比1:(2.5～3.7)配比；更優(yōu)選按質(zhì)量比1:(3.0～3.2)配比。

14、所述的水優(yōu)選為純凈水。

15、所述的蛋白胨的用量優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的2.5％～3.7％(w/w)計(jì)算；更優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的3％～3.2％(w/w)計(jì)算。

16、所述的葡萄糖的用量優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的15％～25％(w/w)計(jì)算；更優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的18％～22％(w/w)計(jì)算。

17、所述的蔗糖的用量優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的10％～20％(w/w)計(jì)算；更優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的14％～16％(w/w)計(jì)算。

18、所述的鼠李糖的用量優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的1％～4％(w/w)計(jì)算；更優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的2％～3％(w/w)計(jì)算。

19、所述的檸檬酸鈉的用量優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的2％～8％(w/w)計(jì)算；更優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的4％～6％(w/w)計(jì)算。

20、所述的磷酸二氫鉀的用量優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的0.7％～0.8％(w/w)計(jì)算；更優(yōu)選按其為化橘紅樹葉質(zhì)量的0.72％～0.78％(w/w)計(jì)算。

21、所述的勻漿的條件優(yōu)選為6000～10000r/min下勻漿10～20min；更優(yōu)選為7000～8000r/min下勻漿14～16min。

22、所述的滅菌的條件優(yōu)選為121℃滅菌15～25min；更優(yōu)選為121℃滅菌16～20min。

23、所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液通過如下步驟制備：將枯草芽孢桿菌保存菌種接種到液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液。

24、所述的液體培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖70～90g/l、蛋白胨9～11g/l、酵母膏9～11g/l、磷酸二氫鉀2～3g/l、硫酸鎂0.3～0.5g/l，調(diào)節(jié)ph?6.8～7.2，溶劑為水；更優(yōu)選如下：葡萄糖80g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、磷酸二氫鉀2.4g/l、硫酸鎂0.4g/l，調(diào)節(jié)ph7.0，溶劑為水。

25、所述的枯草芽孢桿菌的接種量優(yōu)選為每100ml～200ml液體培養(yǎng)基接種2環(huán)菌苔。

26、所述的振蕩培養(yǎng)的條件優(yōu)選為36～38℃、180～220r/min下培養(yǎng)8～12h；更優(yōu)選為37℃、200r/min下培養(yǎng)9～11h。

27、所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的接種量優(yōu)選按其為發(fā)酵培養(yǎng)基用水體積量的0.1％～1.2％計(jì)算；更優(yōu)選按其為發(fā)酵培養(yǎng)基用水體積量的0.2％～1.0％計(jì)算。

28、所述發(fā)酵條件優(yōu)選為：溫度35～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200～240r/min，發(fā)酵0～12h通氣比控制為0.24～0.32vvm，發(fā)酵13～24h通氣比控制為0.36～0.48vvm，發(fā)酵25～40h通氣比控制為0.36～0.40vvm，發(fā)酵41h及以后通氣比控制為0.32～0.36vvm，發(fā)酵周期56～64h。

29、步驟(2)中：

30、所述的煮沸的條件優(yōu)先為100℃下加熱5～15min；更優(yōu)選為100℃下加熱8～14min。

31、所述的勻漿的條件優(yōu)選為7000～8000r/min下勻漿14～16min。

32、所述的離心分離的條件優(yōu)選為6000～7000r/min下離心18～22min。

33、所述的乙酸乙酯的加入量優(yōu)選為上清液體積的0.8～1.2倍。

34、所述的混合液靜置時(shí)間優(yōu)選為30～40min。

35、步驟(3)中：

36、所述的大孔樹脂優(yōu)選為hpd600大孔樹脂。

37、所述的處理后的上清液上柱吸附時(shí)的流速優(yōu)選為1.4～1.8bv/h。

38、所述的洗柱的水的ph優(yōu)選為4.0～4.2。

39、所述的洗柱的水的用量優(yōu)選為上清液體積的20％～24％。

40、所述的洗柱的水的流速優(yōu)選為2～3bv/h。

41、所述的用于解吸的甲醇溶液濃度優(yōu)選為90％～100％(v/v)。

42、所述的甲醇溶液解吸時(shí)的流速優(yōu)選為0.5～0.6bv/h。

43、步驟(4)中：

44、所述的水優(yōu)選為純水。

45、所述的水的加入量優(yōu)選為上清液體積的3.5％～5％。

46、所述的蒸餾溫度優(yōu)選為90～100℃。

47、所述的濃縮液須達(dá)到上清液體積的3％～4.5％。

48、所述的結(jié)晶的條件優(yōu)選為3～5℃下靜置64～72h。

49、所述的離心分離的條件優(yōu)選為7500～8500r/min下離心18～22min。

50、步驟(5)中：

51、所述的堿性的水的ph優(yōu)選為7.4～7.8。

52、所述的濕固體沉淀物溶于堿性水的固液比(w/v，g/ml)優(yōu)選為1:240～280。所述的大孔樹脂優(yōu)選為hpd600大孔樹脂。

53、所述的上柱吸附中的流速優(yōu)選為1.0～1.4bv/h。

54、所述的洗柱中的水的ph優(yōu)選為4.0～4.2。

55、所述的洗柱中的水的用量優(yōu)選為上清液體積的19％～23％。

56、所述的洗柱中的水的流速優(yōu)選為2～3bv/h。

57、所述的甲醇溶液的濃度優(yōu)選為90％～100％(v/v)。

58、所述的甲醇溶液解吸時(shí)的流速優(yōu)選為0.5～0.6bv/h。

59、步驟(6)中：

60、所述的水優(yōu)選為純水。

61、所述的水的加入量優(yōu)選為上清液體積的7％～9％。

62、所述的蒸餾溫度優(yōu)選為90～100℃。

63、所述的濃縮液須達(dá)到上清液體積的6％～8％。

64、所述的結(jié)晶的條件優(yōu)選為3～5℃下靜置64～72h。

65、所述的離心分離的條件優(yōu)選為7500～8500r/min下離心18～22min。

66、所述的烘干的條件優(yōu)選105～115℃。

67、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

68、(1)本發(fā)明篩選得到的枯草芽孢桿菌jh03可用于發(fā)酵法提高化橘紅樹葉中柚皮苷含量。

69、(2)未有以化橘紅樹葉提取柚皮苷的生產(chǎn)先例，也未有利用微生物發(fā)酵法提高化橘紅樹葉中柚皮苷含量的研究報(bào)道。本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵化橘紅樹葉，促使化橘紅樹葉中其他黃酮類化合物轉(zhuǎn)化為柚皮苷，從而使提取液中柚皮苷含量顯著增大，與未經(jīng)發(fā)酵的對照比較，柚皮苷提取得率是對照的1.6倍以上。所得的提取物可以作為中成藥、功能性食品、抗菌化妝品等的原料，也可以作為進(jìn)一步提純柚皮苷的原料，有利于促進(jìn)化橘紅樹葉的高附加值開發(fā)利用。