本發(fā)明屬于植物基因工程，具體涉及一個(gè)基因ospp2act及其編碼蛋白質(zhì)在水稻紋枯病抗性中的改良和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、紋枯病是水稻三大病害之一，主要危害葉鞘、葉片，具有危害大、流行性強(qiáng)、寄主范圍廣等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。水稻轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，具有周期短、效率高等特點(diǎn)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)水稻基因進(jìn)行操作已經(jīng)培育了大量的水稻抗病及高產(chǎn)新品種。但是由于抗紋枯病基因資源匱乏及抗病機(jī)理研究滯后，抗紋枯病育種一直進(jìn)展緩慢。發(fā)掘抗紋枯病基因可為抗紋枯病分子育種提供基因資源和理論基礎(chǔ)。

2、2a類蛋白磷酸酶(protein?phosphatase?2a，pp2a)是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，可參與蛋白的去磷酸化修飾過(guò)程，有助于調(diào)控多種植物信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、代謝途徑和細(xì)胞死亡，對(duì)提高作物抗逆性具有重要意義。pp2a全酶是一種異源三聚體，由結(jié)構(gòu)亞基a、調(diào)節(jié)亞基b和保守的催化亞基c組成。各亞基以單體形式或由催化亞基與結(jié)構(gòu)亞基組成的核心酶形式存在，b亞基的多樣化決定了全酶底物識(shí)別和亞細(xì)胞定位的廣泛變異性。然而，有關(guān)水稻蛋白磷酸酶pp2a與水稻紋枯病抗性的關(guān)系還沒(méi)有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供ospp2act基因在改良水稻紋枯病抗性中的應(yīng)用，本發(fā)明鑒定了一個(gè)新的水稻紋枯病抗性調(diào)控基因ospp2act，本發(fā)明通過(guò)對(duì)ospp2a家族進(jìn)行紋枯病抗性鑒定及表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)基因ospp2act會(huì)降低水稻對(duì)紋枯病抗性，而利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)敲除該基因會(huì)增強(qiáng)水稻對(duì)紋枯病抗性。表明ospp2act負(fù)調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性水平，在培育抗紋枯病水稻品種中具有較好的應(yīng)用前景，可以有效提高水稻對(duì)紋枯病的抗性。

2、本發(fā)明還提供所述基因編碼的蛋白及其應(yīng)用。

3、技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述ospp2act基因在調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性中的應(yīng)用，所述ospp2act基因的序列如seq?id?no.1。

4、其中，所述過(guò)量表達(dá)基因ospp2act會(huì)降低水稻對(duì)紋枯病抗性，而敲除該基因會(huì)增強(qiáng)水稻對(duì)紋枯病抗性。

5、本發(fā)明所述ospp2act基因編碼的ospp2act蛋白質(zhì)在調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性中的應(yīng)用，所述ospp2act蛋白質(zhì)由seq?id?no.1編碼，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

6、本發(fā)明所述與所述的ospp2act基因具有75％或75％以上同一性、或者與所述的ospp2act基因雜交，且編碼ospp2act蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子在調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性中的應(yīng)用。

7、本發(fā)明所述含有所述的ospp2act基因的重組載體、重組微生物或者轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系在調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性中的應(yīng)用。

8、其中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體；所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌；所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系不包括繁殖材料。

9、本發(fā)明所述的ospp2act基因或者ospp2act蛋白質(zhì)或者所述的重組載體、重組微生物或者轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系在培育增強(qiáng)抗紋枯病的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明所述一種培育紋枯病抗性降低或者提高的轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括增強(qiáng)或降低受體水稻中ospp2act蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因水稻；所述轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性低于/高于所述受體水稻。

11、其中，所述轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性高于/低于所述受體水稻體現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因水稻的紋枯病病斑長(zhǎng)度小于/高于受體水稻。

12、其中，所述增強(qiáng)或降低受體水稻中ospp2act蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或活性的方法是通過(guò)對(duì)所述受體水稻中ospp2act蛋白質(zhì)的編碼基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲除來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

13、本發(fā)明所述的培育紋枯病抗性降低或者提高的轉(zhuǎn)基因水稻的方法在創(chuàng)制水稻紋枯病抗性新種質(zhì)中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明中是上述所述水稻品種具體可為dongjin。

15、本發(fā)明通過(guò)反向遺傳學(xué)鑒定到一個(gè)基因ospp2act。ospp2act編碼水稻2a型蛋白磷酸酶pp2a家族的一個(gè)催化亞基。紋枯病抗性鑒定結(jié)果表明，ospp2act負(fù)調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性，即敲除ospp2act基因會(huì)提高水稻對(duì)紋枯病的抗性，而過(guò)表達(dá)ospp2act則顯著削弱水稻紋枯病抗性。這些結(jié)果表明，ospp2act作為紋枯病負(fù)調(diào)控基因，在抗紋枯病分子育種中有重要的應(yīng)用潛力。

16、本發(fā)明所述應(yīng)用中所述抗病性可為紋枯病抗性；所述調(diào)控具體體現(xiàn)在：當(dāng)植物中的ospp2act蛋白的活性和/或含量降低時(shí)，所述植物對(duì)紋枯病的抗性提高；當(dāng)植物中的ospp2act蛋白的活性和/或含量提高時(shí)，所述植物對(duì)紋枯病的抗性降低。

17、其中，所述植物育種具體可為創(chuàng)制水稻紋枯病抗性新種質(zhì)。

18、上述方法中，所述降低受體水稻中的ospp2act基因表達(dá)量和/或活性的主要步驟如下：(1)目的基因片段的獲得。在本發(fā)明中，所有候選基因的目的片段均通過(guò)pcr技術(shù)擴(kuò)增自日本晴cdna對(duì)應(yīng)的基因。(2)將目的基因片段連接至中間(克隆)載體8/gw/takit；(3)挑選陽(yáng)性克隆并測(cè)序證實(shí)；陽(yáng)性克隆質(zhì)粒和終載體質(zhì)?；旌线M(jìn)行重組反應(yīng)；(4)pcr及質(zhì)粒酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克??；(5)重組型陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌；(6)陽(yáng)性農(nóng)桿菌單克隆的驗(yàn)證和保存。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，總rna的提取選自4-5葉期的日本晴幼苗整株組織(以葉片為株)，按照trizol法(invitrogen公司)進(jìn)行；總cdna的合成使用primescript?rtreagent?kit?with?gdnaeraser試劑盒(takara公司)進(jìn)行；重組質(zhì)粒的提取使用e.z.n.a.tm?plasmid?midi?kit試劑盒(omega公司)進(jìn)行。增強(qiáng)受體水稻中的ospp2act基因表達(dá)量和/或活性是采用高保真dna聚合酶擴(kuò)增獲得水稻蛋白磷酸酶催化亞基(ser/thr-pp2acatalytic?subunit,pp2ac)基因(命名為ospp2act)的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，通過(guò)psti將目標(biāo)基因?qū)胗蓮?qiáng)啟動(dòng)子ubi啟動(dòng)的超表達(dá)載體pcambia1390。

19、通過(guò)實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)結(jié)果顯示ospp2act主要在葉和葉鞘中高表達(dá)，這與水稻紋枯病主要危害葉鞘的特點(diǎn)相吻合(如圖1a)，并且ospp2act基因的表達(dá)能在紋枯病菌侵染后被誘導(dǎo)上調(diào)(如圖1b)，暗示ospp2act基因與水稻紋枯病抗性密切相關(guān)。通過(guò)紋枯病抗性鑒定顯示轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)株系紋枯病病斑長(zhǎng)度顯著高于野生型，基因編輯系紋枯病病斑長(zhǎng)度顯著低于野生型。綜合上述結(jié)果表明，ospp2act基因可以調(diào)控水稻紋枯病抗性。

20、本發(fā)明通過(guò)qrt-pcr表達(dá)分析，鑒定到了水稻葉鞘中特異表達(dá)的ospp2a基因—ospp2act(loc_os02g12580)，其位于第2染色體上，全長(zhǎng)4850bp，有5個(gè)內(nèi)含子，其中編碼序列(coding?sequence，cds)編碼308個(gè)氨基酸。在紋枯病菌侵染后，發(fā)現(xiàn)該基因受到極顯著的誘導(dǎo)表達(dá)，暗示ospp2act基因與水稻紋枯病抗性密切相關(guān)。進(jìn)一步，利用超表達(dá)技術(shù)增強(qiáng)ospp2act基因的表達(dá)量以及基因編輯技術(shù)敲除ospp2act基因，證實(shí)了該基因可以負(fù)調(diào)控水稻對(duì)紋枯病抗性，并對(duì)轉(zhuǎn)基因系的紋枯病抗性性狀進(jìn)行考察，獲得了對(duì)紋枯病抗性顯著提高的水稻新材料。

21、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

22、本發(fā)明鑒定了一個(gè)新的調(diào)控水稻紋枯病抗性的基因，為水稻紋枯病抗性改良提供新的基因資源，獲得了增強(qiáng)水稻紋枯病抗性的水稻新種質(zhì)。本發(fā)明鑒定得到一個(gè)調(diào)控水稻紋枯病抗性基因ospp2act。沉默或者敲除該基因可顯著增強(qiáng)水稻對(duì)紋枯病的抗性，過(guò)表達(dá)該基因則減弱了水稻對(duì)紋枯病的抗性，表明所述基因在抗紋枯病分子育種上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。