本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)，尤其涉及一種檢測(cè)水稻單細(xì)胞基因序列變異的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、誘變育種是作物中一種常見(jiàn)的育種途徑，在創(chuàng)制生物安全性高、可直接用于種質(zhì)選育的優(yōu)異新基因方面具有較大優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)誘變育種對(duì)植物誘變材料的研究水平多集中在組織、器官水平，這種傳統(tǒng)的測(cè)序思路只能反映細(xì)胞的平均數(shù)據(jù)，不能提供單個(gè)細(xì)胞之間的異質(zhì)性信息，不利于進(jìn)行細(xì)胞水平精細(xì)化、針對(duì)性的變異挖掘和利用，進(jìn)而可能忽略單細(xì)胞中特有的位點(diǎn)變異。

2、隨著基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)變異機(jī)理的研究起到了極大的促進(jìn)作用。全基因組重測(cè)序在植物誘變育種領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，極大地降低某些未知功能的重要基因序列的鑒定障礙，使誘變基因資源得到充分的挖掘和利用，為相關(guān)研究提供技術(shù)支撐。單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)(single-cell?whole-genome?sequencing，scwgs)在單細(xì)胞分辨率下揭示了生物樣本中的基因組異質(zhì)性，彌補(bǔ)傳統(tǒng)測(cè)序方法的不足，幫助我們理解植物發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的獨(dú)特性功能。

3、相對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言，單細(xì)胞測(cè)序在植物中的研究應(yīng)用較少。植物細(xì)胞壁的存在給單細(xì)胞分離與獲取增加了難度，由于目前只能通過(guò)分離原生質(zhì)體的方法對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，這給部分原生質(zhì)體分離存在困難的物種材料造成了較大影響，并且可能導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生偏差，也對(duì)植物單細(xì)胞測(cè)序的普及造成一定困難，因此單細(xì)胞測(cè)序僅在玉米等少數(shù)作物中得到應(yīng)用。

4、水稻作為最重要的糧食作物之一，通過(guò)誘變育種創(chuàng)制新的變異基因和種質(zhì)資源對(duì)保障我國(guó)乃至世界糧食安全具有重要意義。通過(guò)創(chuàng)新水稻小孢子性細(xì)胞等單細(xì)胞的分離技術(shù)、水稻單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)和單細(xì)胞基因序列變異檢測(cè)，對(duì)于深入挖掘和利用誘變處理的水稻單細(xì)胞基因序列變異位點(diǎn)，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)水稻單細(xì)胞基因序列變異的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明中的方法主要包括取樣、測(cè)序和生信分析三方面，其中取樣獲取的是單個(gè)水稻小孢子性細(xì)胞。本發(fā)明成功分離出單個(gè)水稻小孢子性細(xì)胞，并對(duì)已有水稻單細(xì)胞變異檢測(cè)技術(shù)流程所存在的完整性不強(qiáng)、檢測(cè)連貫性有待提升等缺陷進(jìn)行了完善，此外還通過(guò)重離子誘變技術(shù)，鑒定確認(rèn)了變異位點(diǎn)的真實(shí)性。本發(fā)明中的方法拓寬了水稻單細(xì)胞誘變材料的來(lái)源范圍，為創(chuàng)制更多樣的育種材料、進(jìn)行更高效的誘變育種提供了新的思路和方法。同時(shí)小孢子性細(xì)胞作為雄配子，基因組攜帶的突變能夠通過(guò)雜交進(jìn)入子代，可實(shí)現(xiàn)變異的遺傳和固定，也為優(yōu)異變異基因的快速利用提供了途徑。

2、為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種檢測(cè)水稻單細(xì)胞基因序列變異的方法，包括以下步驟：

4、(1)單細(xì)胞分離和dna擴(kuò)增：

5、先通過(guò)拉尖的玻璃毛細(xì)管連接微量注射器制作的簡(jiǎn)易單細(xì)胞分離裝置，吸取單個(gè)存活的單核早期小孢子，然后基于mda?phi29?dna聚合酶等溫?cái)U(kuò)增體系，使用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行單細(xì)胞dna擴(kuò)增；

6、(2)全基因組測(cè)序和數(shù)據(jù)過(guò)濾：

7、先把基因組dna打成dna片段進(jìn)行平末端修復(fù)，然后在dna片段兩端連接da尾，并連接測(cè)序接頭，隨后通過(guò)磁珠進(jìn)行純化，再選擇300-400bp范圍的片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增、純化、質(zhì)檢以及上機(jī)測(cè)序，最后使用軟件fastp過(guò)濾；

8、(3)單細(xì)胞基因組的真實(shí)變異鑒定：

9、使用軟件gatk進(jìn)行變異檢測(cè)，按照單倍型的方法獲取snp位點(diǎn)，讓軟件根據(jù)測(cè)序reads的情況直接判斷該位點(diǎn)的堿基類(lèi)型，輸出該位點(diǎn)堿基類(lèi)型；取測(cè)序深度100×?xí)r，雜合率為0.4-0.6的位點(diǎn)作為雜合突變位點(diǎn)；在此范圍外的位點(diǎn)，校正為對(duì)應(yīng)的高頻堿基的純合位點(diǎn)；在此過(guò)程中還要去除因?yàn)榛蚪M背景差異和dna擴(kuò)增過(guò)程錯(cuò)配兩方面原因造成的假陽(yáng)性數(shù)據(jù)，以及使用重離子或γ射線(xiàn)誘變技術(shù)對(duì)小孢子基因序列變異進(jìn)行驗(yàn)證；

10、(4)單細(xì)胞基因組變異的偏好性分析：

11、從單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果中篩選高頻突變基因(hmg)、低頻突變基因(lmg)和無(wú)突變基因(nmg)，在hmg中，snp的數(shù)量和基因的長(zhǎng)度具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系，為了排除基因的長(zhǎng)度對(duì)snp數(shù)量的影響，以snp比例作為篩選指標(biāo)，snp比例為單位長(zhǎng)度(bp)的snp數(shù)量；

12、(5)單細(xì)胞基因組變異的生物信息學(xué)分析：

13、包括a.go富集分析和b.數(shù)據(jù)分析和繪圖。

14、優(yōu)選的，所述單細(xì)胞的分離方法具體為：先通過(guò)fda-pi對(duì)小孢子進(jìn)行染色，然后在20倍物鏡的熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞活性，最后通過(guò)拉尖的玻璃毛細(xì)管連接微量注射器制作的簡(jiǎn)易單細(xì)胞分離裝置，吸取單個(gè)存活的單核早期小孢子。

15、優(yōu)選的，所述單細(xì)胞的dna擴(kuò)增方法具體為：在單細(xì)胞樣品中加入3μl?buffer?d2，輕彈管壁混勻并短暫離心收集；65℃孵育10分鐘；加入3μl?buffer?n，輕彈管壁混勻并短暫離心；將40μl的反應(yīng)混合液加入到準(zhǔn)備好的10μl?dna樣品中，輕彈管壁混勻并短暫離心收集，30℃孵育3-4小時(shí)；65℃孵育5分鐘失活discover-sc?dna?polymerase；將擴(kuò)增好的dna樣品進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，主條帶清晰明亮的dna樣品放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

16、優(yōu)選的，所述通過(guò)磁珠進(jìn)行純化時(shí)具體使用的磁珠為ampure?xp磁珠。

17、優(yōu)選的，所述因?yàn)榛蚪M背景差異造成的假陽(yáng)性數(shù)據(jù)去除方法為：若測(cè)序品種和gatk比對(duì)使用的參考基因組品種不一致，則材料本身的基因組背景有差異，設(shè)置10個(gè)空白對(duì)照樣品，統(tǒng)計(jì)空白對(duì)照樣品的測(cè)序的變異位點(diǎn)，對(duì)比到輻照樣品中，相同的位點(diǎn)即認(rèn)為是來(lái)源于基因組背景的差異，進(jìn)行篩除。

18、優(yōu)選的，所述因?yàn)閐na擴(kuò)增過(guò)程錯(cuò)配造成的假陽(yáng)性數(shù)據(jù)去除方法為：高保真性phi29?dna聚合酶在進(jìn)行整個(gè)水稻基因組的多次的循環(huán)復(fù)制，每個(gè)樣品仍會(huì)產(chǎn)生成千上萬(wàn)的錯(cuò)配位點(diǎn)，但在循環(huán)擴(kuò)增的過(guò)程中錯(cuò)配發(fā)生得越晚，被檢測(cè)到的雜合率就越低，取第一次就發(fā)生錯(cuò)配的極限值，將雜合率低于25％的位點(diǎn)進(jìn)行校正，改為對(duì)應(yīng)的高頻堿基的基因型，篩除擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的假陽(yáng)性。

19、優(yōu)選的，所述使用重離子或γ射線(xiàn)誘變技術(shù)對(duì)小孢子基因序列變異進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，所使用的重離子為3-5gy的重離子，γ射線(xiàn)為9-11gy的γ射線(xiàn)。

20、進(jìn)一步優(yōu)選的，所使用的重離子為4gy的重離子，γ射線(xiàn)為10gy的γ射線(xiàn)。

21、優(yōu)選的，所述go富集分析的方法為：將目標(biāo)基因向go數(shù)據(jù)庫(kù)的各term映射，并計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)，從而得到具有某個(gè)go功能的基因列表及基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)；使用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在目標(biāo)基因中顯著富集的go?term；將目標(biāo)基因集與go數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)聯(lián)，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行g(shù)o富集分析，獲取基因顯著富集的go?term；所述數(shù)據(jù)分析和繪圖的方法為：生物信息相關(guān)數(shù)據(jù)的整理和分析使用的是microsoft?excel?2016和spss19.0，使用origin?2022進(jìn)行圖形的繪制。

22、本發(fā)明還提供了所述方法在水稻育種中的應(yīng)用。

23、本發(fā)明的有益效果是：

24、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足：(1)細(xì)胞是生命體最基本的結(jié)構(gòu)單位，傳統(tǒng)的測(cè)序方法只能反映細(xì)胞的平均數(shù)據(jù)，不能提供單個(gè)細(xì)胞之間的異質(zhì)性信息；單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)測(cè)序方法的不足，但目前在作物中的研究應(yīng)用較少，在水稻中，單細(xì)胞測(cè)序的取樣、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析的方法有待完善。植物細(xì)胞壁的存在給單細(xì)胞分離與獲取增加了難度，不同物種、組織及發(fā)育階段的細(xì)胞壁厚度不同，且原生質(zhì)體的分離過(guò)程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)的變化，但目前只能通過(guò)分離原生質(zhì)體的方法對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。這給部分原生質(zhì)體分離存在困難的物種材料造成了較大影響，并且可能導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生偏差，也對(duì)植物單細(xì)胞測(cè)序的普及造成一定困難。(2)水稻性細(xì)胞在單細(xì)胞水平的取樣、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析全流程操作步驟不夠完善。

25、本發(fā)明的創(chuàng)新之處主要體現(xiàn)在：本發(fā)明基于新興發(fā)展的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，以單核早期小孢子為材料，完善了水稻性細(xì)胞的取樣、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析流程，首次建立了較為完善的水稻小孢子性細(xì)胞在單細(xì)胞水平的變異檢測(cè)體系，并進(jìn)行了實(shí)例驗(yàn)證。本發(fā)明技術(shù)指標(biāo)清晰、可操作性強(qiáng)、可進(jìn)行批量化變異檢測(cè)，為高效批量進(jìn)行水稻性細(xì)胞突變體的變異檢測(cè)提供技術(shù)體系支撐。

26、具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

27、(1)材料來(lái)源方面，目前水稻上進(jìn)行研究的誘變材料多集中在組織、器官層級(jí)，難以進(jìn)行單細(xì)胞水平上精細(xì)變異的研究。

28、本發(fā)明成功分離出單個(gè)水稻小孢子性細(xì)胞，進(jìn)行重離子誘變，鑒定確認(rèn)了變異位點(diǎn)的真實(shí)性。該發(fā)明拓寬了水稻單細(xì)胞誘變材料的來(lái)源范圍，為創(chuàng)制更多樣的育種材料、進(jìn)行更高效的誘變育種提供了新的思路和方法。同時(shí)小孢子性細(xì)胞作為雄配子，基因組攜帶的突變能夠通過(guò)雜交進(jìn)入子代，實(shí)現(xiàn)變異的遺傳和固定，為優(yōu)異變異基因的快速利用提供途徑。

29、(2)檢測(cè)流程方面，已有的水稻的單細(xì)胞變異檢測(cè)技術(shù)流程的完整性不強(qiáng)，檢測(cè)的連貫性有待提升。

30、本發(fā)明完善了相關(guān)檢測(cè)流程，主要包括三方面的流程：取樣、測(cè)序和生信分析：

31、a.取樣方面的創(chuàng)新之處主要在于單細(xì)胞分離和dna擴(kuò)增技術(shù)的創(chuàng)新。本發(fā)明利用簡(jiǎn)易單細(xì)胞分離裝置，吸取單個(gè)存活的單核早期小孢子，并確認(rèn)了利用基于mda的phi29dna聚合酶等溫?cái)U(kuò)增體系對(duì)單細(xì)胞dna進(jìn)行擴(kuò)增，符合后續(xù)單細(xì)胞測(cè)序的質(zhì)量要求。

32、b.測(cè)序方面利用磁珠法進(jìn)行dna純化，針對(duì)性選擇300-400bp范圍的片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，提高了測(cè)序質(zhì)量，并能夠順利獲取小孢子單細(xì)胞水平的基因組，為后續(xù)變異做好基礎(chǔ)數(shù)據(jù)準(zhǔn)備。

33、c.分析方面步驟的創(chuàng)新主要是真實(shí)變異位點(diǎn)的鑒定。確認(rèn)小孢子單細(xì)胞在重離子誘變后發(fā)生了基因組水平上可檢測(cè)的真實(shí)性突變，意義重大，只有鑒定確認(rèn)能夠誘發(fā)真實(shí)變異，本發(fā)明的誘發(fā)小孢子基因組變異的方法，才可確認(rèn)為有效。

34、此外，變異位點(diǎn)檢測(cè)和真實(shí)變異鑒定，在技術(shù)分析上明確了假陽(yáng)性數(shù)據(jù)來(lái)自“基因組背景差異”和“dna擴(kuò)增錯(cuò)配引入的假陽(yáng)性變異位點(diǎn)”這兩個(gè)方面，并進(jìn)行針對(duì)性的濾除步驟，有效保證了數(shù)據(jù)的真實(shí)性，為后續(xù)進(jìn)行基因功能分析奠定基礎(chǔ)。