本發(fā)明屬于病毒檢測，具體涉及一種用于鑒別表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株的引物、試劑盒、方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、傳染性法氏囊病病毒(ibdv)引起雞的傳染性法氏囊病(ibd)，該病是一種急性、高度接觸傳染性、殺淋巴細(xì)胞性疾病，主要發(fā)生于3～8周齡的幼雞。病雞精神沉郁、羽毛蓬亂、下痢、震顫、共濟失調(diào)。該病的發(fā)病率可達(dá)100％，死亡率5％～15％，有時高達(dá)20％以上，并發(fā)或繼發(fā)感染所致的死亡率更高。該病于1957年首次爆發(fā)于美國，現(xiàn)已大面積流行于歐州、東南亞、非州、南美洲，被世界動物衛(wèi)生組織(oie)列為“影響社會經(jīng)濟的重要疾病”。ibd在我國的流行情況也比較嚴(yán)重，一直威脅著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展?？乖儺?、免疫抑制，特別是超強毒株(vvibdv)的出現(xiàn)，使得該病的防控形勢更加嚴(yán)峻。疫苗免疫是防控vvibdv的主要手段，但vvibdv致病性強且不適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)，疫苗株的獲得只能通過將野生vvibdv在雞胚或cef細(xì)胞上傳代致弱。這種傳統(tǒng)的馴化方法費時費力，且結(jié)果帶有隨機性。因此，開展新型疫苗的快速構(gòu)建具有重要意義。

2、重組活載體疫苗是用基因工程技術(shù)將病毒或細(xì)菌構(gòu)建成一個載體，然后把外源基因插入其中使之表達(dá)的活疫苗。該類疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的免疫比較廣泛，可以同時表達(dá)多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，起到一針防多病的效果，是當(dāng)今和未來疫苗研發(fā)的主要方向之一。馬立克氏病病毒(mdv)屬于α-皰疹病毒科馬立克氏病毒屬，基因組為線性雙股dna，分子量約為166-180kb。該皰疹病毒基因組較大，可供外源基因插入或替換的復(fù)制非必需基因多，是一種理想的構(gòu)建重組活載體疫苗的病毒載體。本發(fā)明發(fā)明人在前期的研究中，建立了mdv弱毒疫苗814株多片段粘粒感染性克隆拯救系統(tǒng)(公開于申請公布號為cn104830883a的發(fā)明專利申請中)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明發(fā)明人在mdv基因組中鑒定出可供外源基因插入的復(fù)制非必需區(qū)，并將ibdv?vp2基因插入mdv基因組us2基因的內(nèi)部，構(gòu)建了表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株，用于免疫無特定病原雞(spf雞)能使spf雞產(chǎn)生良好的對抗ibdv的抗體，同時還不影響mdv的免疫效果(公開于授權(quán)公告號為cn105695423b的發(fā)明專利)。由于md疫苗能夠預(yù)防腫瘤的形成，但不能阻止mdv野毒株的感染，疫苗毒株可以與野毒株共存于雞體內(nèi)。而表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株作為可以預(yù)防m(xù)d和ibd的二價活疫苗，在雞體內(nèi)疫苗毒株和野毒株的鑒別檢測對于md的診斷、疫苗的免疫監(jiān)控等都具有重要意義。目前尚沒有一種有效的、準(zhǔn)確的區(qū)分表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株和野毒株的pcr檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了鑒別檢測表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株(rmdv-vp2)與其他不含有ibdvvp2基因的mdv毒株，進(jìn)而實現(xiàn)md的診斷及監(jiān)控表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株的免疫情況，本發(fā)明針對外源插入片段中的目的基因序列設(shè)計上游引物vp2f，針對親本病毒缺失片段設(shè)計上游引物us2pf，針對插入位點3’端旁側(cè)序列設(shè)計下游引物us2r，利用上述引物，以待測病毒基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴增，可以特異性檢測重組疫苗株rmdv-vp2中的外源插入片段及插入位置，并且可以區(qū)分rmdv-vp2與其他不含有ibdv?vp2基因的mdv毒株。

2、為解決上述技術(shù)問題并達(dá)到相應(yīng)的技術(shù)效果，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個目的是提供了一種用于鑒別表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的引物，所述引物包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的上游引物vp2f和核苷酸序列如seq?id?no.3所示的下游引物us2r。

4、本發(fā)明的第二個目的是提供上述引物在制備用于鑒別表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的試劑盒中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有上述引物的試劑盒。

6、本發(fā)明的第四個目的是提供上述引物或上述試劑盒在鑒別表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株中的應(yīng)用。

7、本發(fā)明的第五個目的是提供一種用于區(qū)分表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株與不含有傳染性法氏囊病病毒vp2基因的雞馬立克氏病病毒的引物，所述引物包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的上游引物vp2f、核苷酸序列如seq?idno.2所示的上游引物us2pf和核苷酸序列如seq?id?no.3所示的下游引物us2r。

8、本發(fā)明的第六個目的是提供上述引物在制備用于區(qū)分表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株與不含有傳染性法氏囊病病毒vp2基因的雞馬立克氏病病毒的試劑盒中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明的第七個目的是提供一種含有上述引物的試劑盒。

10、本發(fā)明的第八個目的是提供上述引物或上述試劑盒在區(qū)分表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株與不含有傳染性法氏囊病病毒vp2基因的雞馬立克氏病病毒中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明的第九個目的是提供一種區(qū)分表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株與不含有傳染性法氏囊病病毒vp2基因的雞馬立克氏病病毒的方法，所述方法以待測病毒基因組dna為模板，使用核苷酸序列如seq?id?no.1所示的上游引物vp2f、核苷酸序列如seq?id?no.2所示的上游引物us2pf和核苷酸序列如seq?id?no.3所示的下游引物us2r進(jìn)行pcr擴增，瓊脂糖凝膠電泳判斷擴增產(chǎn)物的片段大小，若擴增產(chǎn)物片段大小為2840bp，則待測病毒為表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株；若擴增產(chǎn)物片段大小為814bp，則待測病毒為不含有傳染性法氏囊病病毒vp2基因的雞馬立克氏病病毒。

12、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述pcr反應(yīng)的體系為5×prime?star?gxl反應(yīng)緩沖液10μl，2.5mmol/l的dntp?mixture?4μl，10pmol/μl的上游引物vp2f、上游引物us2pf和下游引物us2r各1μl，1.25u/μl的primestar?gxl?dna?polymerase?1μl，100ng/μl的基因組dna?1μl，雙蒸水31μl。

13、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述pcr反應(yīng)的程序為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，35個循環(huán)；72℃再延伸10min。

14、本發(fā)明的第十個目的是提供上述方法在診斷雞馬立克氏病或監(jiān)控表達(dá)傳染性法氏囊病病毒vp2基因的重組mdv疫苗株的免疫情況中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明的有益效果：

16、為了區(qū)分表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株與其他不含有ibdv?vp2基因的mdv毒株，進(jìn)而實現(xiàn)md的診斷及監(jiān)控表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株的免疫情況，本發(fā)明根據(jù)重組疫苗株與親本毒的差異主要在于重組疫苗株含有vp2基因表達(dá)框架(親本病毒沒有)，同時重組疫苗株缺失了us2基因部分序列(親本病毒含有)的特征，針對外源插入片段中的目的基因序列設(shè)計上游引物vp2f，針對親本病毒缺失片段設(shè)計上游引物us2pf，針對插入位點3’端旁側(cè)序列設(shè)計下游引物us2r。利用引物vp2f和us2r進(jìn)行pcr，能夠特異性檢測重組疫苗株(rmdv-vp2)中的外源插入片段及插入位置；利用引物vp2f、us2pf和us2r進(jìn)行pcr，可以區(qū)分重組疫苗株(rmdv-vp2)與其他不含有ibdv?vp2基因的mdv毒株。本發(fā)明提供的pcr方法能鑒別檢驗表達(dá)ibdv?vp2基因的重組mdv疫苗株與其他mdv毒株，對于雞馬立克氏病的診斷、疫苗的免疫監(jiān)控等具有重要意義。