發(fā)明領(lǐng)域提供了免疫球蛋白樣結(jié)合蛋白，其包含與免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，還提供了結(jié)合蛋白，其具有與輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，以及與重鏈恒定結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。還提供了表達(dá)此類結(jié)合蛋白的細(xì)胞，制造它們的小鼠，以及相關(guān)的方法和組合物。

背景技術(shù)：

0、背景

1、抗體通常包含四聚體結(jié)構(gòu)，其具有兩條相同的重鏈，每條重鏈包含與重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)相融合的重鏈恒定區(qū)(ch)，所述重鏈與同輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)相融合的輕鏈恒定區(qū)(cl)相締合。對于典型的人igg，抗體分子大小大致為約150kda至約170kda(例如，對于igg3，其包含較長的鉸鏈區(qū))，這取決于igg的亞類(例如，igg1，igg3，igg4)和可變區(qū)的(變化的)長度。

2、在典型的抗體中，vh與vl結(jié)構(gòu)域相締合以形成結(jié)合靶抗原的結(jié)合位點。因此，關(guān)于親和力和特異性的抗體的特點可大部分地取決于vh和vl結(jié)構(gòu)域的特點。在人和小鼠中的典型抗體中，vh結(jié)構(gòu)域與λ或κvl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。然而，也已知的是可制造這樣的vl結(jié)構(gòu)域：其在沒有同源vh結(jié)構(gòu)域(例如，在抗體的情境中天然表達(dá)且與特定vl結(jié)構(gòu)域相締合的vh結(jié)構(gòu)域)的情況下特異性結(jié)合靶抗原，而且可以分離這樣的vh結(jié)構(gòu)域：其在沒有同源vl結(jié)構(gòu)域的情況下特異性結(jié)合靶抗原。因此，基于免疫球蛋白的結(jié)合蛋白的有用的多樣性通常是由產(chǎn)生特定vh或vl(以及體細(xì)胞超突變，在其發(fā)生的程度上)的重組以及同源vh/vl對的組合所賦予的。開發(fā)組合物和方法來開拓其它的多樣性來源將是有用的。

3、本領(lǐng)域中需要基于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白，這包括免疫球蛋白可變區(qū)例如輕鏈可變區(qū)，且包括相對于傳統(tǒng)抗體顯示出提高的多樣性的結(jié)合蛋白。也存在對于制造有用的結(jié)合蛋白的其它方法和動物的需求，所述結(jié)合蛋白包括：包含多種輕鏈免疫球蛋白可變區(qū)序列的結(jié)合蛋白。還需要用于基于免疫球蛋白的結(jié)合蛋白的有用形式，其提供用于從中選擇的結(jié)合蛋白的增強(qiáng)的多樣性，以及免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的增強(qiáng)的多樣性，這包括用于產(chǎn)生體細(xì)胞突變的和克隆選擇的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的組合物和方法，所述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域用于例如制造人治療劑。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概要

1、一方面，描述了結(jié)合蛋白，其包含免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域衍生自輕鏈(即kappa(κ)和/或lambda(λ))免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，但不是來自全長重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。還提供了用于制造結(jié)合蛋白的組合物和方法，包括經(jīng)遺傳修飾的小鼠。

2、一方面，提供了核酸構(gòu)建體，細(xì)胞，胚胎，小鼠和方法，用于制造包含一個或多個κ和/或λ輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白序列及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列的蛋白，其中包括包含人λ或κ輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列的蛋白。

3、一方面，提供了小鼠，其包含免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座包括用一個或多個輕鏈可變區(qū)(vl)基因區(qū)段以及一個或多個輕鏈連接區(qū)(jl)基因區(qū)段替代內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白重鏈基因座處的一個或多個免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(vh)基因區(qū)段，重鏈多樣性(dh)基因區(qū)段，和重鏈連接(jh)基因區(qū)段。

4、一方面，提供了小鼠，其包括免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座包含用一個或多個vl基因區(qū)段以及一個或多個jl基因區(qū)段替代全部或基本上全部vh，dh及jh基因區(qū)段，以在內(nèi)源重鏈基因座(vlh基因座)處形成vl基因區(qū)段序列，其中所述vlh基因座能夠與內(nèi)源小鼠ch基因重組以形成重排的基因，其衍生自vl基因區(qū)段，jl基因區(qū)段和內(nèi)源小鼠ch基因。

5、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段是人vl。在一個實施方案中，所述jl區(qū)段為人jl。在具體的實施方案中，所述vl和jl區(qū)段是人vl和人jl區(qū)段。

6、在一個實施方案中，用至少六個人vκ基因區(qū)段和至少一個jκ基因區(qū)段替代全部或基本上全部vh，dh以及jh基因區(qū)段。在一個實施方案中，用至少16個人vκ基因區(qū)段(人vκ)和至少一個jκ基因區(qū)段替代全部或基本上全部vh，dh和jh基因區(qū)段。在一個實施方案中，用至少30個人vκ基因區(qū)段和至少一個jκ基因區(qū)段替代全部或基本上全部vh，dh和jh基因區(qū)段。在一個實施方案中，用至少40個人vκ基因區(qū)段和至少一個jκ基因區(qū)段替代全部或基本上全部vh，dh和jh基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述至少一個jκ基因區(qū)段包含兩個、三個、四個或五個人jκ基因區(qū)段。

7、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段為人vκ區(qū)段。在一個實施方案中，所述人vκ區(qū)段包含4-1，5-2，7-3，2-4，1-5和1-6。在一個實施方案中，所述κvl包含3-7，1-8，1-9，2-10，3-11，1-12，1-13，2-14，3-15，1-16。在一個實施方案中，所述人vκ區(qū)段包含1-17，2-18，2-19，3-20，6-21，1-22，1-23，2-24，3-25，2-26，1-27，2-28，2-29和2-30。在一個實施方案中，所述人vκ區(qū)段包含3-31，1-32，1-33，3-34，1-35，2-36，1-37，2-38，1-39和2-40。

8、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段為人vκ區(qū)段且包含4-1，5-2，7-3，2-4，1-5，1-6，3-7，1-8，1-9，2-10，3-11，1-12，1-13，2-14，3-15和1-16。在一個實施方案中，所述vκ區(qū)段還包含1-17，2-18，2-19，3-20，6-21，1-22，1-23，2-24，3-25，2-26，1-27，2-28，2-29和2-30。在一個實施方案中，所述vκ區(qū)段還包含3-31，1-32，1-33，3-34，1-35，2-36，1-37，2-38，1-39和2-40。

9、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段為人vλ區(qū)段且包含人λ輕鏈基因座的簇(cluster)a的片段。在具體的實施方案中，所述人λ輕鏈基因座的簇a的片段從hvλ3-27延伸至hvλ3-1。

10、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段包含人λ輕鏈基因座的簇b的片段。在具體的實施方案中，所述人λ輕鏈基因座的簇b的片段從hvλ5-52延伸至hvλ1-40。

11、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其包含簇a的基因組片段和簇b的基因組片段。在一個實施方案中，所述人λ輕鏈可變區(qū)序列包含簇a的至少一個基因區(qū)段和簇b的至少一個基因區(qū)段。

12、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段包含簇b的至少一個基因區(qū)段和簇c的至少一個基因區(qū)段。

13、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段包含hvλ3-1，4-3，2-8，3-9，3-10，2-11和3-12。在具體的實施方案中，所述vl區(qū)段包含從vλ3-12跨至vλ3-1的人λ輕鏈基因座的連續(xù)序列。在一個實施方案中，所述連續(xù)序列包含至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個hvλ。在具體的實施方案中，所述hvλ包括3-1，4-3，2-8，3-9，3-10，2-11和3-12。在具體的實施方案中，所述hvλ包含從vλ3-12跨至vλ3-1的人λ基因座的連續(xù)序列。

14、在一個實施方案中，所述hvλ包含13至28個或更多的hvλ。在具體的實施方案中，所述hvλ包括2-14，3-16，2-18，3-19，3-21，3-22，2-23，3-25和3-27。在具體的實施方案中，所述hvλ包含從vλ3-27跨至vλ3-1的人λ基因座的連續(xù)序列。

15、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段包含29至40個hvλ。在具體的實施方案中，所述vl區(qū)段包含從vλ3-29跨至vλ3-1的人λ基因座的連續(xù)序列，以及從vλ5-52跨至vλ1-40的人λ基因座的連續(xù)序列。在具體的實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠中hvλ1-40和hvλ3-29之間的全部或基本上全部序列基本上由下列組成：在自然界中(例如在人類群體中)被發(fā)現(xiàn)在hvλ1-40基因區(qū)段下游(3’未翻譯部分的下游)的約959bp的人λ序列，限制性酶切位點(例如pi-scei)，后跟在自然界中被發(fā)現(xiàn)在hvλ3-29基因區(qū)段上游的約3431bp的人λ序列。

16、在一個實施方案中，所述jκ是人的并且選自jκ1，jκ2，jκ3，jκ4，jκ5及其組合。在具體的實施方案中，所述jκ包含jκ1至jκ5。

17、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段為人vλ區(qū)段，且所述jκ基因區(qū)段包含具有12-mer間隔子的rss，其中所述rss被并置于jκ基因區(qū)段的上游末端。在一個實施方案中，所述vl基因區(qū)段為人vλ且所述vlh基因座包含兩個或更多個jκ基因區(qū)段，其中每個都包含具有12-mer間隔子的rss，其中所述rss被并置于每個jκ基因區(qū)段的上游末端。

18、在具體的實施方案中，所述vl區(qū)段包含從vκ4-1至vκ2-40跨越人κ基因座的連續(xù)人κ基因區(qū)段，且所述jl區(qū)段包含從jκ1至jκ5跨越人κ基因座的連續(xù)基因區(qū)段。

19、在一個實施方案中，其中所述vl區(qū)段為vλ區(qū)段且沒有dh區(qū)段存在于所述vl區(qū)段和j區(qū)段之間，所述vl區(qū)段的下游側(cè)翼(即并置于下游一側(cè))是23-merrss，且jκ區(qū)段(如果存在的話)或jλ區(qū)段(如果存在的話)的上游側(cè)翼(即并置于上游一側(cè))是12-merrss。

20、在一個實施方案中，其中所述v基因區(qū)段為vκ基因區(qū)段且沒有dh基因區(qū)段存在于所述v基因區(qū)段和j基因區(qū)段之間，其中每個所述vκ基因區(qū)段的的下游一側(cè)并置了12-merrss，且每個jκ區(qū)段(如果存在的話)或jλ區(qū)段(如果存在的話)的上游一側(cè)并置了23-merrss。

21、在一個實施方案中，小鼠包含重排的基因，其衍生自vl基因區(qū)段，jl基因區(qū)段和內(nèi)源小鼠ch基因。在一個實施方案中，所述重排的基因是經(jīng)體細(xì)胞突變的。在一個實施方案中，所述重排的基因包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多個n添加。在一個實施方案中，在所述重排的基因中所觀察到的衍生自vl區(qū)段和jl區(qū)段的n添加和/或體細(xì)胞突變是在內(nèi)源輕鏈基因座處重排的重排輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(衍生自相同的vl基因區(qū)段和相同的jl基因區(qū)段)中所觀察到的n添加和/或體細(xì)胞突變數(shù)目的1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍或至少5倍。在一個實施方案中，所述重排的基因是特異性結(jié)合目的抗原的b細(xì)胞，其中所述b細(xì)胞以低納摩爾范圍內(nèi)或更低的kd(例如10納摩爾或或更低的kd)結(jié)合目的抗原。在具體的實施方案中，所述vl區(qū)段、jl區(qū)段或二者為人基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述vl和jl區(qū)段為人κ基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述小鼠ch基因選自igm，igd，igg，iga和ige。在具體的實施方案中，所述小鼠igg選自igg1，igg2a，igg2b，igg2c和igg3。在另一個具體實施方案中，所述小鼠igg為igg1。

22、在一個實施方案中，所述小鼠包含b細(xì)胞，其中所述b細(xì)胞從b細(xì)胞染色體上的基因座制造結(jié)合蛋白，其基本上由四條多肽鏈組成，其中所述四條多肽鏈基本上由下列組成：(a)兩條相同的多肽，其包含與vl相融合的內(nèi)源小鼠ch區(qū)；和(b)兩條相同的多肽，其包含與vl區(qū)相融合的內(nèi)源小鼠cl區(qū)，其中所述vl區(qū)相關(guān)于與小鼠ch區(qū)相融合的vl區(qū)是同源的，并且在一個實施方案中為人(例如人κ)vl區(qū)。在一個實施方案中，與內(nèi)源小鼠ch區(qū)相融合的vl區(qū)為人vl區(qū)。在具體的實施方案中，與小鼠ch區(qū)相融合的人vl區(qū)為vκ區(qū)。在具體的實施方案中，與小鼠ch區(qū)相融合的人vl區(qū)與由經(jīng)重排的人種系輕鏈核苷酸序列編碼的v區(qū)相同。在具體的實施方案中，與小鼠ch區(qū)相融合的人vl區(qū)包含兩個、三個、四個、五個、六個或更多個體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，與小鼠ch區(qū)相融合的人vl區(qū)是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加的重排的基因編碼的。

23、在一個實施方案中，小鼠制造的所有igg分子中的至少50％包含這樣的多肽：其包含igg同種型ch區(qū)和vl區(qū)，其中所述多肽的長度不長于535，530，525，520或515氨基酸。在一個實施方案中，所有igg分子中的至少75％包含本段落中所述的多肽。在一個實施方案中，所有igg分子中的至少80％，85％，90％或95％包含本段落中所述的多肽。在具體的實施方案中，由小鼠制造的所有igg分子都包含這樣的多肽：其不長于本段落中所述的多肽的長度。

24、在一個實施方案中，小鼠制造結(jié)合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含與由重排的人v基因區(qū)段及j基因區(qū)段但不是dh基因區(qū)段編碼的可變結(jié)構(gòu)域相融合的內(nèi)源小鼠ch區(qū)，所述第二多肽包含與由重排的人v基因區(qū)段及j基因區(qū)段但不是dh基因區(qū)段編碼的v結(jié)構(gòu)域相融合的內(nèi)源小鼠cl區(qū)，并且所述結(jié)合蛋白以微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的親和力特異性結(jié)合抗原。在一個實施方案中，所述j區(qū)段為人j區(qū)段(例如人κ基因區(qū)段)。在一個實施方案中，所述人v區(qū)段是人vκ區(qū)段。在一個實施方案中，與內(nèi)源小鼠ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域包含比與內(nèi)源小鼠cl區(qū)相融合的可變區(qū)數(shù)目更多的體細(xì)胞超突變；在具體的實施方案中，同與內(nèi)源小鼠cl區(qū)相融合的v區(qū)相比，與內(nèi)源小鼠ch區(qū)相融合的可變區(qū)包含約1.5，2-，3-，4-或5倍或更多的體細(xì)胞超突變；在具體的實施方案中，同與小鼠cl區(qū)相融合的v區(qū)相比，與小鼠ch區(qū)相融合的v區(qū)包含至少6，7，8，9，10，11，12，13，14或15或更多的體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，與小鼠ch區(qū)相融合的v區(qū)是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加的經(jīng)重排的基因編碼的。

25、在一個實施方案中，小鼠表達(dá)結(jié)合蛋白，其包含：與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列相融合的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl1)，和與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)相融合的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl2)，其中vl1包含的體細(xì)胞超突變數(shù)目是vl2中存在的體細(xì)胞超突變數(shù)目的約1.5至約5倍或者更多。在一個實施方案中，vl1中的體細(xì)胞超突變數(shù)目是vl2中的約2至約4倍。在一個實施方案中，vl1中的體細(xì)胞超突變數(shù)目是vl2中的約2至約3倍。在一個實施方案中，vl1是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加的序列編碼的。

26、一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其表達(dá)基本上由下列多肽組成的免疫球蛋白:兩個相同的第一多肽，其中每個都基本上由與可變結(jié)構(gòu)域相融合的ch區(qū)組成，所述可變結(jié)構(gòu)域衍生自基本上由vl基因區(qū)段和jl基因區(qū)段組成的基因區(qū)段；以及兩個相同的第二多肽，其中每個都基本上由與可變結(jié)構(gòu)域相融合的cl區(qū)組成，所述可變結(jié)構(gòu)域衍生自基本上由vl區(qū)段和jl區(qū)段組成的基因區(qū)段。

27、在具體的實施方案中，具有ch區(qū)的所述兩個相同的多肽具有小鼠ch區(qū)。

28、在具體的實施方案中，具有cl區(qū)的所述兩個相同的多肽具有小鼠cl區(qū)。

29、在一個實施方案中，與cl區(qū)融合的可變結(jié)構(gòu)域是同與ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域同源的可變結(jié)構(gòu)域。

30、在一個實施方案中，與內(nèi)源小鼠ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域包含比與內(nèi)源小鼠cl區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域數(shù)目更多的體細(xì)胞超突變；在具體的實施方案中，同與內(nèi)源小鼠cl區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域相比，與內(nèi)源小鼠ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域包含約1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍或5倍或更多的體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，與內(nèi)源小鼠cl區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多個n添加的基因編碼的。

31、在一個實施方案中，一個或多個所述v區(qū)段和j區(qū)段是人基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述v區(qū)段和j區(qū)段都是人κ基因區(qū)段。在另一個具體實施方案中，所述v區(qū)段和j區(qū)段都是人λ基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述v區(qū)段和j區(qū)段獨立地選自人κ和人λ基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述v區(qū)段為vκ區(qū)段且j區(qū)段為jλ區(qū)段。在另一個具體實施方案中，所述v區(qū)段為vλ區(qū)段且所述j區(qū)段為jκ區(qū)段。

32、在一個實施方案中，與cl區(qū)相融合的一個或多個可變結(jié)構(gòu)域以及與ch區(qū)相融合的可變結(jié)構(gòu)域為人可變結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方案中，所述人可變結(jié)構(gòu)域為人vκ結(jié)構(gòu)域。在另一個具體實施方案中，所述人可變結(jié)構(gòu)域為vλ結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述人結(jié)構(gòu)域獨立地選自人vκ和人vλ結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方案中，與cl區(qū)相融合的所述人可變結(jié)構(gòu)域為人vλ結(jié)構(gòu)域且與ch區(qū)相融合的人可變結(jié)構(gòu)域為人vκ結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，與cl區(qū)相融合的人可變結(jié)構(gòu)域為人vκ結(jié)構(gòu)域且與ch相融合的人可變結(jié)構(gòu)域為人vλ結(jié)構(gòu)域。

33、在一個實施方案中，所述兩個相同的第一多肽的vl基因區(qū)段選自人vλ區(qū)段和人vκ區(qū)段。在一個實施方案中，所述兩個相同的第二多肽的vl區(qū)段選自人vλ區(qū)段和人vκ區(qū)段。在具體的實施方案中，所述兩個相同的第一多肽的vl區(qū)段是人vκ區(qū)段且所述兩個相同的第二多肽的vl區(qū)段選自人vκ區(qū)段和人vλ區(qū)段。在具體的實施方案中，所述兩個相同的第一多肽的vl區(qū)段是人vλ區(qū)段且所述兩個相同的第二多肽的vl區(qū)段選自人vλ區(qū)段和人vκ區(qū)段。在具體的實施方案中，所述兩個相同的第一多肽的人vl區(qū)段是人vκ區(qū)段，且所述兩個相同的第二多肽的人vl區(qū)段是人vκ區(qū)段。

34、在一個實施方案中，小鼠的igg包括響應(yīng)于抗原而制造的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含基本上由可變結(jié)構(gòu)域和ch區(qū)組成的多肽，其中所述可變結(jié)構(gòu)域是由基本上由經(jīng)重排的vl區(qū)段和經(jīng)重排的j區(qū)段組成的核苷酸序列編碼的，并且其中所述結(jié)合蛋白以微摩爾，納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的kd特異性結(jié)合抗原的表位。

35、一方面，提供了小鼠，其中小鼠響應(yīng)于抗原而制造的全部或基本上全部igg都包含含有可變結(jié)構(gòu)域的重鏈，其中所述可變結(jié)構(gòu)域是由衍生自基本上由v基因區(qū)段和j基因區(qū)段組成的基因區(qū)段的重排的基因編碼的。在一個實施方案中，所述重排的基因包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加。

36、在一個實施方案中，所述v區(qū)段是輕鏈的v區(qū)段。在一個實施方案中，所述輕鏈選自κ輕鏈和λ輕鏈。在具體的實施方案中，所述輕鏈為κ輕鏈。在具體的實施方案中，所述v區(qū)段為人v區(qū)段。在具體的實施方案中，所述v區(qū)段為人vκ區(qū)段且所述j區(qū)段為人jκ區(qū)段。

37、在一個實施方案中，所述j區(qū)段為輕鏈的j區(qū)段。在一個實施方案中，所述輕鏈選自κ輕鏈和λ輕鏈。在具體的實施方案中，所述輕鏈為κ輕鏈。在具體的實施方案中，所述j區(qū)段為人j區(qū)段。在另一個實施方案中，所述j區(qū)段為重鏈的j區(qū)段(即jh)。在具體的實施方案中，所述重鏈為小鼠來源的。在另一個具體實施方案中，所述重鏈為人來源的。

38、在一個實施方案中，由不超過v區(qū)段和j區(qū)段構(gòu)成的重鏈的可變結(jié)構(gòu)域是體細(xì)胞突變的可變結(jié)構(gòu)域。

39、在一個實施方案中，由不超過v區(qū)段和j區(qū)段構(gòu)成的重鏈的可變結(jié)構(gòu)域與小鼠ch區(qū)融合。

40、在具體的實施方案中，由小鼠響應(yīng)于抗原而制造的全部或基本上全部igg都包含衍生自不超過一個人v區(qū)段和不超過一個人j區(qū)段的可變結(jié)構(gòu)域，并且所述可變結(jié)構(gòu)域與小鼠igg恒定區(qū)相融合，且其中igg還包含含有與小鼠cl區(qū)相融合的人vl結(jié)構(gòu)域的輕鏈。在具體的實施方案中，與小鼠cl區(qū)相融合的vl結(jié)構(gòu)域衍生自人vκ區(qū)段和人jκ區(qū)段。在具體的實施方案中，與小鼠cl區(qū)相融合的vl結(jié)構(gòu)域衍生自人vλ區(qū)段和人jλ區(qū)段。

41、一方面，提供了小鼠，其制造在包含ch區(qū)的多肽上含有第一cdr3且在包含cl區(qū)的多肽上含有第二cdr3的igg，其中所述第一cdr3和第二cdr3各自獨立地衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述兩個基因區(qū)段基本上由vl基因區(qū)段和jl基因區(qū)段組成。在一個實施方案中，包含ch區(qū)的多肽上的cdr3含有下列序列：所述序列衍生自包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加的cdr3核苷酸序列。

42、在一個實施方案中，所述vl區(qū)段和jl區(qū)段為人基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述vl區(qū)段和jl區(qū)段為κ基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述vl區(qū)段和jl區(qū)段為λ基因區(qū)段。

43、一方面，提供了小鼠，其制造在含有ch區(qū)的第一多肽上包含第一cdr3且在含有cl區(qū)的第二多肽上包含第二cdr3的igg，其中所述第一cdr3和第二cdr3二者每個都包含這樣的氨基酸序列：其中超過75％的所述氨基酸衍生自v基因區(qū)段。在一個實施方案中，包含ch區(qū)的所述多肽上的cdr3含有這樣的序列：其衍生自包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加的cdr3核苷酸序列。

44、在一個實施方案中，超過80％，超過90％或超過95％的所述第一cdr3的氨基酸，以及超過80％，超過90％或超過95％的所述第二cdr3的氨基酸衍生自輕鏈v區(qū)段。

45、在一個實施方案中，所述第一cdr3的不超過兩個氨基酸衍生自除輕鏈v區(qū)段之外的基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述第二cdr3的不超過兩個氨基酸衍生自除輕鏈v區(qū)段之外的基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述第一cdr3的不超過兩個氨基酸和所述第二cdr3的不超過兩個氨基酸衍生自除輕鏈v區(qū)段之外的基因區(qū)段。在一個實施方案中，沒有所述igg的cdr3包含衍生自d基因區(qū)段的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述第一多肽的cdr3不包含衍生自d區(qū)段的序列。

46、在一個實施方案中，所述v區(qū)段是人v基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述v區(qū)段是人vκ基因區(qū)段。

47、在一個實施方案中，所述第一和/或第二cdr3具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，所述第一cdr3是由包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加的核酸序列編碼的。

48、在一個實施方案中，所述第一cdr3基本上由衍生自人輕鏈v基因區(qū)段和人輕鏈j基因區(qū)段的氨基酸組成，且所述第二cdr3基本上由衍生自人輕鏈v基因區(qū)段和人輕鏈j基因區(qū)段的氨基酸組成。在一個實施方案中，所述第一cdr3衍生自包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多n添加的核酸序列。在一個實施方案中，所述第一cdr3衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述不超過兩個基因區(qū)段是人vκ基因區(qū)段和人jκ基因區(qū)段；且所述第二cdr3衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述不超過兩個基因區(qū)段是人vκ基因區(qū)段和選自人jκ區(qū)段、人jλ區(qū)段和人jh區(qū)段的j基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述第一cdr3衍生自不超過兩個基因區(qū)段，其中所述不超過兩個基因區(qū)段為人vλ區(qū)段和選自人jκ區(qū)段、人jλ區(qū)段及人jh區(qū)段的j區(qū)段。

49、一方面，提供了小鼠，其制造不含衍生自dh基因區(qū)段的氨基酸序列的igg，其中所述igg包含具有與小鼠cl區(qū)融合的第一vl結(jié)構(gòu)域的第一多肽和具有與小鼠ch區(qū)融合的第二vl結(jié)構(gòu)域的第二多肽，其中所述第一vl結(jié)構(gòu)域和所述第二vl結(jié)構(gòu)域不是相同的。在一個實施方案中，所述第一和第二vl結(jié)構(gòu)域衍生自不同的v區(qū)段。在另一個實施方案中，所述第一和第二vl結(jié)構(gòu)域衍生自不同的j區(qū)段。在一個實施方案中，所述第一和第二vl結(jié)構(gòu)域衍生自相同的v和j區(qū)段，其中與所述第一vl結(jié)構(gòu)域相比，所述第二vl結(jié)構(gòu)域包含更多數(shù)目的體細(xì)胞超突變。

50、在一個實施方案中，所述第一和第二vl結(jié)構(gòu)域獨立地選自人和小鼠vl結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述第一和第二vl結(jié)構(gòu)域獨立地選自vκ和vλ結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方案中，所述第一vl結(jié)構(gòu)域選自vκ結(jié)構(gòu)域和vλ結(jié)構(gòu)域，且所述第二vl結(jié)構(gòu)域為vκ結(jié)構(gòu)域。在另一個具體實施方案中，所述vκ結(jié)構(gòu)域為人vκ結(jié)構(gòu)域。

51、一方面，提供了小鼠，其中由所述小鼠制造的全部或基本上全部igg都基本上由下列組成：具有與小鼠cl結(jié)構(gòu)域融合的第一人vl結(jié)構(gòu)域的輕鏈，以及具有與小鼠ch結(jié)構(gòu)域融合的第二人vl結(jié)構(gòu)域的重鏈。

52、在一個實施方案中，與小鼠ch結(jié)構(gòu)域融合的所述人vl結(jié)構(gòu)域是人vκ結(jié)構(gòu)域。

53、在一個實施方案中，所述第一和第二人vl結(jié)構(gòu)域不是相同的。

54、一方面，提供了小鼠，其中至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或約100％的由所述小鼠制造的免疫球蛋白g基本上由二聚體組成：(a)第一多肽，其基本上由免疫球蛋白vl結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白cl區(qū)組成；和(b)長度不超過535個氨基酸的第二多肽，其中所述第二多肽基本上由ch區(qū)和缺少衍生自dh基因區(qū)段的序列的v結(jié)構(gòu)域組成。

55、在一個實施方案中，所述第二多肽的長度為約435-535個氨基酸。在具體的實施方案中，所述第二多肽的長度為約435-530個氨基酸。在具體的實施方案中，所述第二多肽的長度為約435-525個氨基酸。在具體的實施方案中，所述第二多肽的長度為約435-520個氨基酸。在具體的實施方案中，所述第二多肽的長度為約435-515個氨基酸。

56、在一個實施方案中，在約90％或更多由所述小鼠制造的igg中，所述第二多肽的長度為不超過約535個氨基酸。

57、在一個實施方案中，在約50％或更多由所述小鼠制造的igg中，所述第二多肽的長度不超過約535個氨基酸。在一個實施方案中，在約50％或更多由所述小鼠制造的免疫球蛋白g中，所述第二多肽的長度為不超過約530，525，520，515，510，505，500，495，490，485，480，475，470，465，460，455或450個氨基酸。在一個實施方案中，約60％，70％，80％，90％或95％或更多由所述小鼠制造的igg是所述的長度。在具體的實施方案中，由所述小鼠制造的全部或基本上全部igg是所述的長度。

58、在一個實施方案中，所述第二多肽的v結(jié)構(gòu)域為vl結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方案中，所述第二多肽的v結(jié)構(gòu)域選自vκ和vλ結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方案中，所述第二多肽的v結(jié)構(gòu)域為人vκ或vλ結(jié)構(gòu)域。

59、一方面，提供了小鼠，其從其種系中的核苷酸序列表達(dá)包含輕鏈可變序列(例如v和/或j序列)，dh序列以及重鏈恒定區(qū)的多肽。

60、在一個實施方案中，所述小鼠從內(nèi)源小鼠重鏈基因座表達(dá)所述多肽，所述基因座包含用所述內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的多個人基因區(qū)段替代全部或基本上全部功能性內(nèi)源小鼠重鏈可變基因座基因區(qū)段。

61、在一個實施方案中，所述多肽包含衍生自vλ或vκ基因區(qū)段的vl序列，所述多肽包含衍生自dh基因區(qū)段的cdr3，且所述多肽包含衍生自jh或jλ或jκ基因區(qū)段的序列。

62、在一個實施方案中，所述小鼠包含內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座，所述基因座包含用一個或多個人輕鏈vλ基因區(qū)段替代所有功能性vh基因區(qū)段，其中所述一個或多個人vλ區(qū)段中的每一個都在下游一側(cè)并置了23-mer間隔的重組信號序列(rss)，其中所述vλ區(qū)段與上游和下游并置了12-mer間隔的rss的人或小鼠dh區(qū)段可操作地連接；所述dh基因區(qū)段與上游并置了23-mer間隔的rss的j區(qū)段可操作地連接，所述rss適于與并置于dh基因區(qū)段的12-mer間隔的rss重組；其中所述v，dh和j區(qū)段與編碼重鏈恒定區(qū)的核酸序列可操作地連接。

63、在一個實施方案中，所述小鼠包含內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座，所述基因座包含用一個或多個人vκ基因區(qū)段替代所有功能性vh基因區(qū)段，每個所述vκ基因區(qū)段下游都并置了12-mer間隔的重組信號序列(rss)，其中所述v區(qū)段與上游和下游都并置了23-mer間隔的rss的人或小鼠dh區(qū)段可操作地連接；所述dh區(qū)段與上游并置了12-mer間隔的rss的j區(qū)段可操作地連接，所述rss適于與并置于所述dh區(qū)段的23-mer間隔的rss重組；其中所述v，dh和j基因區(qū)段與編碼重鏈恒定區(qū)的核酸序列可操作地連接。

64、在一個實施方案中，所述重鏈恒定區(qū)為內(nèi)源小鼠重鏈恒定區(qū)。在一個實施方案中，核酸序列編碼選自ch1，鉸鏈，ch2，ch3及其組合的序列。在一個實施方案中，所述ch1，鉸鏈，ch2和ch3中的一個或多個為人的。

65、在一個實施方案中，所述小鼠包含內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座，所述基因座包含用多個人vλ或vκ基因區(qū)段(其中每個人vλ或vκ基因區(qū)段的下游都并置了23-mer間隔的rss)、上游和下游都并置了12-mer間隔的rss的多個人dh區(qū)段、上游和下游都并置了23-mer間隔的rss的多個人j區(qū)段(jh或jλ或jκ)替代所有功能性vh基因區(qū)段，其中所述基因座包含選自ch1，鉸鏈，ch2，ch3及其組合的內(nèi)源小鼠恒定區(qū)序列。在具體的實施方案中，所述小鼠包含全部或基本上全部功能性人vλ或vκ區(qū)段，全部或基本上全部功能性人dh區(qū)段以及全部或基本上全部jh或jλ或jκ區(qū)段。

66、在一個實施方案中，小鼠表達(dá)抗原結(jié)合蛋白，其包含：(a)多肽，所述多肽包含與包含小鼠序列的重鏈恒定序列相連接的人輕鏈序列；和(b)多肽，其包含與人或小鼠輕鏈恒定序列相連接的人輕鏈可變區(qū)。在具體的實施方案中，所述輕鏈序列為人輕鏈序列，并且在暴露于能夠?qū)⒖贵w切割為fc和fab的蛋白酶時，形成包含至少四個輕鏈cdr的全人fab，其中所述至少四個輕鏈cdr選自λ序列，κ序列及其組合。在一個實施方案中，所述fab包含至少五個輕鏈cdr。在一個實施方案中，所述fab包含六個輕鏈cdr。在一個實施方案中，所述fab的至少一個cdr包含衍生自vλ區(qū)段或vκ區(qū)段的序列，且所述至少一個cdr還包含衍生自d區(qū)段的序列。在一個實施方案中，所述至少一個cdr為cdr3且所述cdr衍生自人vκ區(qū)段，人d區(qū)段和人jκ區(qū)段。

67、在一個實施方案中，所述多肽包含衍生自人vλ或vκ基因區(qū)段，人dh基因區(qū)段和人jh或jλ或jκ基因區(qū)段的可變區(qū)。在具體的實施方案中，所述重鏈恒定序列衍生自人ch1和小鼠ch2以及小鼠ch3序列。

68、一方面，提供了小鼠，其在其種系中包含與人j基因區(qū)段以及重鏈恒定區(qū)序列可操作連接的未重排的人vκ或vλ基因區(qū)段，其中所述小鼠表達(dá)包含與重鏈恒定區(qū)相融合的人vκ結(jié)構(gòu)域的vl結(jié)合蛋白，并且其中所述小鼠顯示出在cd19+b細(xì)胞中表達(dá)vl結(jié)合蛋白的脾臟b細(xì)胞群，其中所述cd19+b細(xì)胞包括過渡性b細(xì)胞(cd19+igmhiigdint)和成熟b細(xì)胞(cd19+igmintigdhi)。

69、一方面，提供了小鼠，其在其種系中包含與人j基因區(qū)段和重鏈恒定區(qū)序列可操作連接的未重排的人vκ或vλ基因區(qū)段，其中所述小鼠在b細(xì)胞上表達(dá)包含與重鏈恒定區(qū)相融合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白，其中所述小鼠骨髓中的淋巴細(xì)胞群顯示出數(shù)目與野生型小鼠中的原/前b細(xì)胞群(骨髓中的淋巴細(xì)胞)數(shù)目大致相同的原/前b細(xì)胞群。

70、在一個實施方案中，小鼠包含至少6個未重排的hvκ基因區(qū)段和一個或多個未重排的hjκ基因區(qū)段，并且所述小鼠包含表達(dá)vl結(jié)合蛋白的淋巴細(xì)胞-門控的且igm+的脾細(xì)胞群，其中所述群體至少為野生型小鼠中淋巴細(xì)胞-門控的且igm+的脾細(xì)胞群的75％大。

71、在一個實施方案中，小鼠顯示出總計約90％的igd+細(xì)胞和igm+細(xì)胞的成熟b細(xì)胞-門控的(cd19+)脾細(xì)胞群；在一個實施方案中，經(jīng)修飾的小鼠的igd+細(xì)胞和igm+細(xì)胞的成熟b細(xì)胞-門控的(cd19+)脾細(xì)胞群與野生型小鼠的總igd+細(xì)胞和igm+細(xì)胞中為成熟b細(xì)胞-門控的(cd19+)脾細(xì)胞大致相同(例如在10％之內(nèi)，或5％之內(nèi))。

72、一方面，提供了小鼠，其從其種系內(nèi)經(jīng)修飾的內(nèi)源重鏈基因座表達(dá)免疫球蛋白，其中所述經(jīng)修飾的內(nèi)源重鏈基因座缺少功能性小鼠重鏈v基因區(qū)段且所述基因座包含未經(jīng)重排的輕鏈v基因區(qū)段和未經(jīng)重排的j基因區(qū)段，其中所述未經(jīng)重排的輕鏈v基因區(qū)段和未經(jīng)重排的j基因區(qū)段與重鏈恒定區(qū)序列可操作地連接；其中所述免疫球蛋白基本上由第一多肽和第二多肽組成，其中所述第一多肽包含免疫球蛋白輕鏈序列和免疫球蛋白重鏈恒定序列，且所述第二多肽包含免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)。

73、一方面，提供了小鼠，其表達(dá)免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白缺少重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，且所述免疫球蛋白包含衍生自輕鏈基因的第一可變結(jié)構(gòu)域，和衍生自輕鏈基因的第二可變結(jié)構(gòu)域，其中所述第一可變結(jié)構(gòu)域和所述第二可變結(jié)構(gòu)域相對于彼此是同源的，其中所述第一和第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域不是相同的，并且其中所述第一和第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域締合，且當(dāng)它們締合時特異性結(jié)合目的抗原。

74、一方面，提供了小鼠，其從其種系中的未重排基因區(qū)段制造免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含完全衍生自基本上由未重排的人基因區(qū)段組成的基因區(qū)段的可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白包含選自ch1，鉸鏈，ch2，ch3及其組合的免疫球蛋白輕鏈恒定序列和免疫球蛋白重鏈恒定序列。

75、一方面，提供了小鼠，其從其種系中未經(jīng)重排的基因區(qū)段制造免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含可變區(qū)和任選地一個或多個體細(xì)胞超突變(例如一個或多個n添加)，其中所有可變區(qū)的所有cdr3都是完全從輕鏈v和j基因區(qū)段產(chǎn)生的。

76、一方面，提供了小鼠，其制造衍生自所述小鼠的種系中未經(jīng)重排的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的體細(xì)胞突變的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白缺少包含衍生自d基因區(qū)段的序列的cdr，其中所述免疫球蛋白在與輕鏈恒定區(qū)融合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域上包含第一cdr3，在與重鏈恒定區(qū)融合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域上包含第二cdr3，并且其中所述第二cdr3衍生自包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多個n添加的經(jīng)重排的輕鏈可變區(qū)序列。

77、一方面，提供了本文中所述的小鼠，其中所述小鼠包含選自λ基因座、κ基因座及其組合的功能上被沉默的輕鏈基因座。在一個實施方案中，所述小鼠包含λ和/或κ基因座的完全或部分缺失，從而所述λ和/或κ基因座是無功能的。

78、一方面，提供了小鼠胚胎，其包含含有如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座的細(xì)胞。在一個實施方案中，所述小鼠為嵌合體且所述胚胎的細(xì)胞的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％包含如本文中所述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實施方案中，所述胚胎的細(xì)胞的至少96％，97％，98％，99％或99.8％包含本文中所述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實施方案中，所述胚胎包含宿主細(xì)胞和衍生自供體es細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述衍生自供體es細(xì)胞的細(xì)胞包含如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實施方案中，所述胚胎為2-，4-，8-，16-，32-或64-細(xì)胞階段的宿主胚胎，或胚泡，并且還包含含有如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座的供體es細(xì)胞。

79、一方面，提供了用本文中所描述的核酸構(gòu)建體制造的小鼠或細(xì)胞。

80、一方面，提供了用本文中所描述的細(xì)胞制造的小鼠。在一個實施方案中，所述細(xì)胞為小鼠es細(xì)胞。

81、一方面，提供了使用本文中所描述的小鼠來制造編碼與第二人輕鏈免疫球蛋白可變序列(vl2)同源的第一人輕鏈免疫球蛋白可變序列(vl1)的核酸序列的用途，其中與人免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(多肽1)融合的vl1同與人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(多肽2)融合的vl2一起作為多肽1/多肽2的二聚體表達(dá)，以形成vl1-vl2抗體。

82、一方面，提供了使用本文中所描述的小鼠來制造編碼與人免疫球蛋白重鏈序列相融合的人免疫球蛋白輕鏈可變序列的核酸序列的用途，其中所述核酸序列編碼人vl-ch多肽，其中所述人vl-ch多肽作為二聚體表達(dá)，并且其中所述二聚體在沒有免疫球蛋白輕鏈(例如沒有人λ或人κ輕鏈)時表達(dá)。在一個實施方案中，所述vl-ch二聚體在沒有λ輕鏈和沒有κ輕鏈時特異性結(jié)合目的抗原。

83、一方面，提供了用如本文中所描述的小鼠來制造編碼全部或一部分免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列的用途。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域為人vλ或人vκ結(jié)構(gòu)域。

84、一方面，提供了用如本文中所描述的小鼠來制造全人fab(包含與人輕鏈恒定區(qū)融合的第一人vl，以及與人重鏈恒定區(qū)序列融合的第二人vl)或全人f(ab)2的用途。

85、一方面，提供了用如本文中所描述的小鼠來制造永生細(xì)胞系的用途。在一個實施方案中，所述永生細(xì)胞系包含這樣的核酸序列：其編碼與包含小鼠恒定區(qū)核酸序列的核酸序列可操作連接的人vλ或vκ結(jié)構(gòu)域。

86、一方面，提供了用本文中所描述的小鼠來制造雜交瘤或四價體瘤(quadroma)的用途。

87、一方面，提供了細(xì)胞，其包含如本文中所描述的經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座。在一個實施方案中，所述細(xì)胞選自全能細(xì)胞、多能細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips)和es細(xì)胞。在具體的實施方案中，所述細(xì)胞為小鼠細(xì)胞，例如小鼠es細(xì)胞。在一個實施方案中，所述細(xì)胞對于經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座為純合的。

88、一方面，提供了細(xì)胞，其包含編碼第一多肽的核酸序列，所述第一多肽包含與人重鏈恒定區(qū)序列相融合的第一體細(xì)胞突變的人vκ或vλ序列。

89、在一個實施方案中，所述細(xì)胞還包含第二多肽鏈，其包含與人輕鏈恒定區(qū)序列相融合的第二體細(xì)胞突變的人vκ或vλ序列。

90、在一個實施方案中，所述第一多肽的人vκ或vλ序列與所述第二多肽的人vκ或vλ序列同源。

91、在一個實施方案中，所述第一多肽的vκ或vλ和所述第二多肽的人vκ或vλ在締合時特異性地結(jié)合目的抗原。在具體的實施方案中，所述第一多肽包含基本上由人vκ組成的可變結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含由與所述第一多肽的人vκ同源的人vκ組成的可變結(jié)構(gòu)域，且所述人恒定區(qū)序列為igg序列。

92、在一個實施方案中，所述細(xì)胞選自cho細(xì)胞，cos細(xì)胞，293細(xì)胞，hela細(xì)胞和表達(dá)病毒核酸序列的人視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如perc.6tm細(xì)胞)。

93、一方面，提供了小鼠體細(xì)胞，其包含含有如本文所述的遺傳修飾的染色體。

94、一方面，提供了小鼠生殖細(xì)胞，其包含含有如本文所述的遺傳修飾的核酸序列。

95、一方面，提供了衍生自如本文中所描述的小鼠的多能、誘導(dǎo)的多能或全能細(xì)胞。在具體的實施方案中，所述細(xì)胞為小鼠胚胎干(es)細(xì)胞。

96、一方面，提供了本文所描述的細(xì)胞用于生產(chǎn)小鼠，細(xì)胞或治療性蛋白(例如抗體或其它抗原結(jié)合蛋白)的用途。

97、一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游和下游并置了23-mer間隔的rss的人dh基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含：與包含人vκ基因區(qū)段的人基因組序列同源的同源臂。在一個實施方案中，靶向構(gòu)建體包含全部或基本上全部的人dh基因區(qū)段，每個都在上游和下游并置了23-mer間隔的rss。

98、一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游并置了12-mer間隔的rss的人jκ基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第一同源臂，其含有與上游和下游并置了23-mer間隔的rss的人基因組dh基因序列的同源性。在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第二同源臂，其含有與人基因組j基因序列的同源性、或含有與小鼠重鏈恒定區(qū)序列的同源性或含有與小鼠恒定區(qū)重鏈序列上游的j-c基因間序列的同源性。

99、一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含下游并置了23-mer間隔的rss的人vλ區(qū)段、上游和下游并置了12-mer間隔的rss的人dh區(qū)段、以及人j區(qū)段，所述j區(qū)段選自上游并置了23-mer間隔的rss的jκ區(qū)段，上游并置于23-mer間隔的rss的人jλ區(qū)段以及上游并置了23-mer間隔的rss的人jh區(qū)段。在一個實施方案中，所述構(gòu)建體包含同源臂，其含有與小鼠恒定區(qū)序列、j-c基因間小鼠序列和/或人vλ序列的同源性。

100、在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其含有人λ輕鏈基因座的簇a的片段。在具體的實施方案中，所述人λ輕鏈基因座簇a的片段從hvλ3-27延伸至hvλ3-1。

101、在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其含有人λ輕鏈基因座的簇b的片段。在具體的實施方案中，所述人λ輕鏈基因座的簇b的片段從hvλ5-52延伸至hvλ1-40。

102、在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含人λ輕鏈可變區(qū)序列，其含有簇a的基因組片段和簇b的基因組片段。在一個實施方案中，所述人λ輕鏈可變區(qū)序列包含簇a的至少一個基因區(qū)段和簇b的至少一個基因區(qū)段。

103、在一個實施方案中，所述人λ輕鏈可變區(qū)序列包含簇b的至少一個基因區(qū)段和簇c的至少一個基因區(qū)段。

104、一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游和下游并置了23-mer間隔的rss的人dh區(qū)段，所述23-mer間隔的rss通常在自然界中被發(fā)現(xiàn)位于jκ，jh，vλ或vh區(qū)段的側(cè)翼。在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第一同源臂，其與人v-j基因間區(qū)同源或與包含人v基因區(qū)段的人基因組序列同源。在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第二同源臂，其與人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列同源。在具體的實施方案中，所述人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列選自ch1，鉸鏈，ch2，ch3及它們的組合。在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含上游側(cè)接了12-mer?rss的人j基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含第二同源臂，其含有與上游側(cè)接了12-mer?rss的j基因區(qū)段的同源性。在一個實施方案中，所述j基因區(qū)段選自人jκ，人jλ和人jh。

105、一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含上游和下游并置了23-mer間隔的rss的人dh區(qū)段，以及位點特異性重組酶識別序列，例如被位點特異性重組酶(例如cre，flp或dre蛋白)識別的序列。

106、一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含人vλ或人vκ區(qū)段，上游和下游并置了12-mer或23-mer間隔的rss的dh區(qū)段，以及具有12-mer或23-mer間隔的rss的人j區(qū)段，其中所述12-mer或23-mer間隔的rss位于緊鄰人j區(qū)段5’處(即相對于轉(zhuǎn)錄的方向)。在一個實施方案中，所述構(gòu)建體包含與3’23-mer間隔的rss并置的人vλ、上游和下游并置了12-mer間隔的rss的人dh區(qū)段，和并置了5’23-mer間隔的rss的人jκ區(qū)段。在一個實施方案中，所述構(gòu)建體包含并置了3’12-mer間隔的rss的人vκ，上游和下游并置了23-mer間隔的rss的人dh區(qū)段以及并置了5’12-mer間隔的rss的人jλ區(qū)段。

107、一方面，提供了靶向載體，其包含：(a)第一靶向臂和第二靶向臂，其中所述第一和第二靶向臂獨立地選自人和小鼠靶向臂，其中所述靶向臂將載體導(dǎo)向內(nèi)源或經(jīng)修飾的免疫球蛋白v區(qū)基因基因座；和(b)人vl基因區(qū)段的連續(xù)序列或人vl基因區(qū)段的連續(xù)序列以及至少一個人jκ基因區(qū)段，其中所述連續(xù)序列選自(i)hvκ4-1至hvκ1-6以及jκ1，(ii)hvκ4-1至hvκ1-6以及jκ1至jκ2，(iii)hvκ4-1至hvκ1-6以及jκ1至jκ3，(iv)hvκ4-1至hvκ1-6以及jκ1至jκ4，(v)hvκ4-1至hvκ1-6以及jκ1至jκ5，(vi)hvκ3-7至hvκ1-16，(vii)hvκ1-17至hvκ2-30，(viii)hvκ3-31至hvκ2-40，和(ix)它們的組合。

108、在一個實施方案中，將載體導(dǎo)向內(nèi)源或經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座的靶向臂與內(nèi)源或經(jīng)修飾的免疫球蛋白基因座處的序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同。

109、一方面，提供了本文所描述的核酸構(gòu)建體用于制造小鼠、細(xì)胞或治療性蛋白(例如抗體或其它抗原結(jié)合蛋白)的用途。

110、一方面，提供了來自本文所描述的小鼠的核酸序列用于制造細(xì)胞系的用途，所述細(xì)胞系用于制造人治療劑。在一個實施方案中，所述人治療劑為結(jié)合蛋白，其包含與人重鏈恒定序列相融合的人輕鏈可變序列(例如衍生自人vκ或人vκ區(qū)段)。在一個實施方案中，所述人治療劑包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽為人λ或κ免疫球蛋白輕鏈，所述第二多肽包含與人重鏈恒定序列相融合的人vλ或人vκ可變序列。

111、一方面，提供了表達(dá)系統(tǒng)，其包含以dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞，所述構(gòu)建體編碼包含與人ch結(jié)構(gòu)域相融合的經(jīng)體細(xì)胞突變的人vl結(jié)構(gòu)域的多肽。

112、在一個實施方案中，所述表達(dá)系統(tǒng)還包含核苷酸序列，其編碼與人cl結(jié)構(gòu)域相融合的免疫球蛋白vl結(jié)構(gòu)域，其中所述與人cl結(jié)構(gòu)域相融合的vl結(jié)構(gòu)域是與人ch結(jié)構(gòu)域相融合的vl結(jié)構(gòu)域的同源輕鏈。

113、在一個實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞選自cho細(xì)胞，cos細(xì)胞，vero細(xì)胞，293細(xì)胞以及表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如per.c6tm細(xì)胞)。

114、一方面，提供了用于制造結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括：從來自本文所描述的小鼠的細(xì)胞的、編碼與ch區(qū)相融合的vl區(qū)的基因獲得編碼vl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；將所述編碼vl區(qū)序列的核苷酸序列與編碼人ch區(qū)的基因同框克隆以形成人結(jié)合蛋白序列；在合適的細(xì)胞中表達(dá)所述人結(jié)合蛋白序列。

115、在一個實施方案中，小鼠經(jīng)過了目的抗原免疫接種，且所述與ch區(qū)融合的vl區(qū)特異性結(jié)合(例如以微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的kd)所述目的抗原的表位。在一個實施方案中，編碼與ch區(qū)融合的vl區(qū)的核苷酸序列是在小鼠中經(jīng)體細(xì)胞突變的。

116、在一個實施方案中，所述合適的細(xì)胞選自b細(xì)胞，雜交瘤，四價體瘤，cho細(xì)胞，cos細(xì)胞，293細(xì)胞，hela細(xì)胞和表達(dá)病毒核酸序列的人視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如perc.6tm細(xì)胞)。

117、在一個實施方案中，所述ch區(qū)包含人igg同種型。在具體的實施方案中，所述人igg選自igg1，igg2和igg4。在另一個具體實施方案中，所述人igg為igg1。在另一個具體實施方案中，所述人igg為igg4。在另一個具體實施方案中，所述人igg4是經(jīng)修飾的igg4。在一個實施方案中，所述經(jīng)修飾的igg4在鉸鏈區(qū)包含取代。在具體的實施方案中，相對于野生型人igg4，所述經(jīng)修飾的igg4在氨基酸殘基228處包含取代，編號是根據(jù)kabat的eu編號索引。在具體的實施方案中，在氨基酸殘基228處的取代為s228p取代，編號是根據(jù)kabat的eu編號索引。

118、在一個實施方案中，所述細(xì)胞還包含編碼vl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，所述vl結(jié)構(gòu)域來自同與ch區(qū)相融合的vl結(jié)構(gòu)域同源的輕鏈，并且所述方法還包括表達(dá)編碼與人cκ或cλ結(jié)構(gòu)域相融合的同源vl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。

119、一方面，提供了制造經(jīng)遺傳修飾的小鼠的方法，所述方法包括用一個或多個人免疫球蛋白輕鏈基因區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的一個或多個小鼠免疫球蛋白重鏈基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述替代是用一個或多個功能性人輕鏈區(qū)段(即vl和jl區(qū)段)替代全部或基本上全部功能性小鼠免疫球蛋白重鏈區(qū)段(即vh，dh和jh區(qū)段)。在一個實施方案中，所述替代是用全部或基本上全部人vλ或vκ區(qū)段以及至少一個jλ或jκ區(qū)段替代全部或基本上全部功能性小鼠重鏈vh、dh和jh區(qū)段。在具體的實施方案中，所述替代包括全部或基本上全部功能性人jλ或jκ區(qū)段。

120、一方面，提供了用于制造表達(dá)多肽的小鼠的方法，所述多肽包含衍生自與小鼠重鏈恒定區(qū)相融合的人免疫球蛋白vλ或vκ和/或jλ或jκ區(qū)段的序列，其包含用至少一個人vλ或vκ區(qū)段以及至少一個人jλ或jκ區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白可變區(qū)段(vh，dh和jh)，其中所述替代在多能、誘導(dǎo)的多能或全能小鼠細(xì)胞中以形成經(jīng)遺傳修飾的小鼠祖細(xì)胞；所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠祖細(xì)胞被引入小鼠宿主中；并且包含經(jīng)遺傳修飾的祖細(xì)胞的所述小鼠宿主經(jīng)受孕以形成包含衍生自經(jīng)遺傳修飾的小鼠祖細(xì)胞的基因組的小鼠。在一個實施方案中，所述宿主為胚胎。在具體的實施方案中，所述宿主選自小鼠前-桑葚胚(例如8-或4-細(xì)胞階段)，四倍體胚胎，胚胎細(xì)胞聚集物或胚泡。

121、一方面，提供了用于制造如本文所述的經(jīng)遺傳修飾的小鼠的方法，所述方法包括通過核轉(zhuǎn)移將含有本文所述的修飾的核酸引入細(xì)胞中，以及在合適的條件下(例如包括培養(yǎng)所述細(xì)胞和在小鼠代孕母親中孕育包含所述細(xì)胞的胚胎)維持所述細(xì)胞以發(fā)育成為如本文所述的小鼠。

122、一方面，提供了用于制造經(jīng)修飾的小鼠的方法，所述方法包括如本文所述的修飾小鼠es細(xì)胞或多能或全能或誘導(dǎo)的多能小鼠細(xì)胞以包括與免疫球蛋白重鏈恒定序列可操作連接的一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變基因區(qū)段，培養(yǎng)所述es細(xì)胞，將所培養(yǎng)的es細(xì)胞引入宿主胚胎中以形成嵌合胚胎，以及將所述嵌合胚胎引入合適的宿主小鼠中以發(fā)育成為經(jīng)修飾的小鼠。在一個實施方案中，所述一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段為人λ或人κ基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段包含人vλ或人vκ區(qū)段和一個或多個jλ，jκ或jh區(qū)段。在一個實施方案中，所述重鏈恒定基因序列為人序列，其選自ch1，鉸鏈，ch2，ch3以及它們的組合。在一個實施方案中，所述一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變基因區(qū)段替代內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的全部或基本上全部功能性內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因區(qū)段，并且所述重鏈恒定序列為包含ch1，鉸鏈，ch2和ch3的小鼠序列。

123、一方面，提供了在本文所述的小鼠中制造的免疫球蛋白可變區(qū)(vr)(例如包含與人jl或jh或dh和jh或dh和jl相融合的人vl序列)。在具體的實施方案中，所述免疫球蛋白vr衍生自選自vκ區(qū)段和vλ區(qū)段的種系人基因區(qū)段，其中所述vr是由小鼠的經(jīng)重排的序列編碼的，其中所述經(jīng)重排的序列是經(jīng)體細(xì)胞超突變的。在一個實施方案中，所述經(jīng)重排的序列包含1至5個體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，所述經(jīng)重排的序列包含至少6，7，8，9或10個體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，所述經(jīng)重排的序列包含超過10個體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，所述經(jīng)重排的序列與一個或多個人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列(例如選自人或小鼠ch1，鉸鏈，ch2，ch3以及它們的組合)相融合。

124、一方面，提供了在本文所述的小鼠中制造的結(jié)合蛋白的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。在一個實施方案中，所述vr與一個或多個人或小鼠重鏈恒定區(qū)序列(例如選自人或小鼠ch1，鉸鏈，ch2，ch3以及它們的組合)相融合。

125、一方面，提供了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其由衍生自本文所述的小鼠的核酸序列編碼。

126、一方面，提供了抗體或其抗原結(jié)合片段(例如fab，f(ab)2，scfv)，其在本文所述的小鼠中制造，或衍生自在本文所述的小鼠中制造的序列。