本發(fā)明涉及一種發(fā)夾dna、基于crispr/cas13a系統(tǒng)的化學(xué)生物傳感器檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、電化學(xué)生物傳感器是一種結(jié)合了生物分子識(shí)別和電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換的先進(jìn)技術(shù)，旨在實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高選擇性的生物分子檢測(cè)。其發(fā)展背景可以追溯到20世紀(jì)60年代初期，當(dāng)時(shí)化學(xué)傳感器技術(shù)的發(fā)展奠定了電化學(xué)生物傳感器的理論基礎(chǔ)。然而，直到20世紀(jì)80年代末和90年代初，隨著生物分子工程學(xué)的進(jìn)步和電化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，電化學(xué)生物傳感器才開始快速發(fā)展。

2、首先，電化學(xué)技術(shù)的進(jìn)步對(duì)電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展至關(guān)重要。包括微電極、電化學(xué)納米材料和電化學(xué)生物傳感器工作原理的理論研究，為傳感器的靈敏度、響應(yīng)速度和穩(wěn)定性提供了技術(shù)支持。特別是納米技術(shù)的應(yīng)用使得電極表面積增大，電化學(xué)活性提高，從而提升了傳感器的檢測(cè)靈敏度。

3、其次，生物分子工程學(xué)的進(jìn)步推動(dòng)了電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展。通過(guò)重組dna技術(shù)和蛋白工程技術(shù)，研究人員能夠設(shè)計(jì)和生產(chǎn)高度特異性的生物分子識(shí)別元件，如酶、抗體、dna和rna。這些生物分子可以與目標(biāo)分子高效結(jié)合，作為傳感器的生物識(shí)別層。

4、其中，作為現(xiàn)今廣受關(guān)注的一項(xiàng)生物分子技術(shù)，crispr/cas(clusteredregularly?interspaced?short?palindromic?repeats/crispr-associated?proteins)系統(tǒng)的發(fā)展是基因組編輯和生物傳感器領(lǐng)域的一大革新，它來(lái)源于20世紀(jì)90年代末期的基礎(chǔ)科學(xué)研究。crispr是一種原始的細(xì)菌免疫系統(tǒng)，其特征是在細(xì)菌基因組中以重復(fù)序列和間隔序列的形式存在。這些序列與過(guò)去感染細(xì)菌的病毒的dna片段高度同源性，表明它們可能是一種天然的免疫系統(tǒng)。cas蛋白則是與crispr序列共同發(fā)現(xiàn)的，這些蛋白質(zhì)在細(xì)菌中發(fā)揮著切割和破壞病毒基因組的作用。關(guān)鍵的技術(shù)突破發(fā)生在2012年，當(dāng)時(shí)美國(guó)和歐洲的研究團(tuán)隊(duì)分別由jennifer?doudna與emmanuelle?charpentier以及feng?zhang領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)，幾乎同時(shí)發(fā)表了關(guān)于如何利用crispr/cas系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯的重要研究。特別是zhang團(tuán)隊(duì)使用crispr/cas9系統(tǒng)成功地進(jìn)行了靶向基因編輯，這一系統(tǒng)利用cas9蛋白和兩段rna序列(crrna和tracrrna或合并為sgrna)來(lái)識(shí)別和切割特定的dna序列。這種方法極大地簡(jiǎn)化了基因編輯的過(guò)程，并提高了編輯的精確性和效率。隨后，科學(xué)家們開始探索其他類型的crispr/cas系統(tǒng)，如crispr/cas12和crispr/cas13。crispr/cas12(包括cpf1)與cas9類似，但在結(jié)構(gòu)和工作機(jī)制上有所不同，其具有更廣泛的靶向序列選擇性。crispr/cas13則專門用于靶向rna的編輯和調(diào)控，這為基因表達(dá)調(diào)控和病毒基因組干預(yù)提供了新的可能性。在生物傳感器領(lǐng)域，crispr技術(shù)的應(yīng)用也在不斷擴(kuò)展。研究人員利用crispr/cas系統(tǒng)的特異性和敏感性，即順式切割和反式切割活性，開發(fā)了各種生物傳感器，用于檢測(cè)病毒、細(xì)菌、基因突變以及環(huán)境中的污染物。這些傳感器利用crispr系統(tǒng)的靶向能力來(lái)識(shí)別并切割特定的dna或rna序列，并產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，使其在醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。

5、最后，生物傳感器的應(yīng)用需求在環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床診斷、食品安全等領(lǐng)域逐漸增加，這推動(dòng)了相關(guān)技術(shù)的研究和開發(fā)。尤其是對(duì)于快速、靈敏、便攜、實(shí)時(shí)檢測(cè)需求的提升，促進(jìn)了電化學(xué)生物傳感器技術(shù)的進(jìn)步和應(yīng)用?？傮w而言，電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展背景是多個(gè)領(lǐng)域技術(shù)的集成和進(jìn)步，特別是電化學(xué)和生物技術(shù)的共同推動(dòng)。這些技術(shù)的融合使得電化學(xué)生物傳感器在醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。

6、目前在臨床應(yīng)用中，生物傳感器的使用已經(jīng)相當(dāng)廣泛，涵蓋了生物標(biāo)志物、感染病原體、抗原抗體和特殊藥物濃度的檢測(cè)。這些生物傳感器的應(yīng)用不僅提高了臨床診斷的精確性和效率，還改善了患者的治療和監(jiān)測(cè)體驗(yàn)。隨著技術(shù)的進(jìn)步和應(yīng)用場(chǎng)景的擴(kuò)展，預(yù)計(jì)生物傳感器在醫(yī)療領(lǐng)域的作用將會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)。

7、結(jié)直腸癌(colorectal?cancer，crc)是全球第三大常見(jiàn)癌癥，發(fā)病率約占癌癥病例總數(shù)的10％(1931590例)，死亡率達(dá)到9.4％(935173例)。亞洲地區(qū)的發(fā)病率(52.3％)和死亡率(54.2％)最高。最新報(bào)告顯示，我國(guó)crc發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中分別位居第二和第五。目前，crc的治療方式包括手術(shù)切除、靶向治療、輔助化療和放療。然而，高達(dá)30％的crc患者在治療后仍會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。因此需要一種可靠的工具對(duì)crc進(jìn)行篩查、診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)。糞便隱血試驗(yàn)和免疫化學(xué)試驗(yàn)可分析糞便中的痕量血液，結(jié)腸鏡檢查能夠?qū)崿F(xiàn)crc的早期檢測(cè)。前者主要是用于大規(guī)模篩查，針對(duì)消化道少量出血的診斷有重要價(jià)值；后者在臨床應(yīng)用廣泛，但不適用于急性腹膜炎、腸穿孔、肛周或腸道嚴(yán)重感染等情況。雖然組織活檢仍然是腫瘤鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該技術(shù)復(fù)雜、有創(chuàng)、成本昂貴，且靈敏度和準(zhǔn)確性受限于組織切片的部位。由于這些篩查方法的局限性，因此有必要開發(fā)一種簡(jiǎn)單、靈敏、微創(chuàng)的檢測(cè)新方法，用于crc的診斷和預(yù)后評(píng)估。

8、microrna(mirna)是一類非編碼的小分子rna，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因蛋白的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要的作用。mirna-21是當(dāng)前研究mirna在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)之一(梁政，等，microrna-21在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展，中國(guó)腫瘤臨床2014年第41卷第24期)。目前檢測(cè)mirna的方法主要是pcr。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、血液中的mirnas是有希望用于微創(chuàng)癌癥診斷的生物標(biāo)記物。在這里，我們提出一種簡(jiǎn)單的融合crispr/cas13a和特殊啞鈴發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無(wú)擴(kuò)增電化學(xué)生物傳感器，以準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血漿標(biāo)本中的mirna，具有高靈敏度和選擇性。

2、本發(fā)明提供了一種發(fā)夾dna，呈雙環(huán)結(jié)構(gòu)，且雙環(huán)中都存在ru-ru的rna序列部分，堿基序列如seq?id?no：1所示：

3、tgaggtctgc/ru-ru/tatgacctcagcctccagtat/ru-ru/cgtctgga?gg。

4、本發(fā)明提供了所述的發(fā)夾dna在檢測(cè)血漿microrna的crispr/cas13a無(wú)擴(kuò)增電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用。

5、其中，所述的電化學(xué)生物傳感器用于診斷結(jié)直腸癌。

6、本發(fā)明提供了一種基于crispr/cas13a系統(tǒng)的化學(xué)生物傳感器檢測(cè)試劑盒，它包含用于混合溶解血漿的反應(yīng)緩沖液、nb.bbvci反應(yīng)體系；

7、所述的反應(yīng)緩沖液包含cas13a蛋白、crrna、權(quán)利要求1所述的發(fā)夾dna、rnase抑制劑、cas13a反應(yīng)buffer；所述的crrna是crrna-21，核苷酸序列如seq?id?no：2所示；

8、所述的nb.bbvci反應(yīng)體系包括：nb.bbvci，rcutsmarttm緩沖液、depc溶液。

9、其中，每18μl的反應(yīng)緩沖液中含有100nm?cas13a蛋白、100nm?crrna、300nm?dh、10u?rnase抑制劑和cas13a反應(yīng)buffer。

10、其中，所述的cas13a反應(yīng)buffer是由10mm?tris-hcl，50mm?kcl，1.5mm?mgcl2組成。

11、本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血漿microrna的crispr/cas13a無(wú)擴(kuò)增電化學(xué)生物傳感器，它包括mch/mb-hp/au電極、所述的檢測(cè)試劑盒。

12、本發(fā)明提供了一種采用電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)血漿中microrna的方法，它包括如下步驟：

13、a、提取血漿總mirna；

14、b、制備mch/mb-hp/au電極；

15、c、取2μl血漿與18μl反應(yīng)緩沖混合，在37℃下孵育30min；

16、d、孵育后的溶液與nb.bbvci反應(yīng)體系混合；取10μl滴加于mch/mb-hp/au電極，37℃孵育90min；反應(yīng)結(jié)束后，用洗滌緩沖液清洗電極表面；

17、e、使用dpv在1×pbs溶液中以0.05v的脈沖幅度在-0.5v至0v范圍內(nèi)采集d步驟反應(yīng)前后的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，將反應(yīng)前的電信號(hào)減去反應(yīng)結(jié)束后的電信號(hào)，得δi值；

18、f、結(jié)果判讀：將檢測(cè)到的δi％代入以下公式，可得血漿mirna-21濃度：cmirna-21＝10(δi％-57.7)/11.3。

19、相比于健康人，結(jié)直腸癌患者mirna-21上調(diào)，濃度更高(參考文獻(xiàn)：10.1016/j.lfs.2022.121340)→(farasati?far?b,vakili?k,fathi?m,yaghoobpoor?s,bhia?m,naimi-jamal?mr.the?role?of?microrna-21(mir-21)in?pathogenesis,diagnosis,andprognosis?of?gastrointestinal?cancers:a?review.life?sci.2023mar1；316:121340.)。

20、相比于傳統(tǒng)pcr，本發(fā)明需要一個(gè)電化學(xué)工作站和一個(gè)三電極工作體系，不像pcr一樣需要特殊的實(shí)驗(yàn)環(huán)境(負(fù)壓和無(wú)rna酶)、專業(yè)的技術(shù)人員和復(fù)雜的樣品前處理(逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增)，成本低、效益高；本發(fā)明建立的電化學(xué)檢測(cè)新方法無(wú)需靶擴(kuò)增和復(fù)雜電極修飾，具有較好的特異性和靈敏度，并成功用于結(jié)直腸癌患者臨床樣品檢測(cè)。