本發(fā)明屬于分子生物檢測(cè)，具體涉及一種用于高原頭痛病輔助診斷的生物標(biāo)志物及其試劑盒。

背景技術(shù)：

1、高原頭痛病(high-altitude?headache,hah)，又稱高原性頭痛或高海拔性頭痛，根據(jù)國(guó)際頭痛病學(xué)會(huì)(international?headache?society,ihs)定義，該病發(fā)生在長(zhǎng)期生活于低海拔地區(qū)的平原人，在未適應(yīng)新環(huán)境的情況下快速進(jìn)入海拔2500米以上的高原后24小時(shí)內(nèi)，表現(xiàn)為雙側(cè)額顳部輕度至中度的鈍痛或壓痛。地理學(xué)上把海拔高于500米，地勢(shì)相對(duì)平坦或者有一定起伏的廣闊地區(qū)叫高原，醫(yī)學(xué)上將海拔高于2500米的地方叫高原。hah發(fā)病率較高，根據(jù)上升速度和具體海拔的不同，發(fā)病率高達(dá)25％至90％(luks,a.m.andp.h.hackett,medical?conditions?and?high-altitude?travel.《the?new?englandjournal?of?medicine》,2022.386(4):p.364-373)。該病危害性很大，不僅會(huì)嚴(yán)重影響急進(jìn)高原人群的日常生活質(zhì)量和降低其工作勞動(dòng)能力，更嚴(yán)重的是，如果hah沒有得到有效的控制與治療，甚至可進(jìn)展成為具有高致死率的高原肺水腫(high-altitude?pulmonaryedema,hape)和高原腦水腫(high-altitude?cerebral?edema,hace)(pham,k.,k.parikhand?e.c.heinrich,hypoxia?and?inflammation:insights?from?high-altitudephysiology.《frontiers?in?physiology》,2021.12:p.676782)。

2、盡管近年來對(duì)hah的診斷進(jìn)行了大量的研究，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)hah的診斷主要依據(jù)患者所表現(xiàn)出的相關(guān)臨床癥狀的強(qiáng)度和特征進(jìn)行診斷。根據(jù)ihs制定的第二版《國(guó)際頭痛分類標(biāo)準(zhǔn)》，診斷hah需符合以下4個(gè)條件：(1)進(jìn)駐到海拔2500米以上高原；(2)頭痛在到達(dá)高原后24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)；(3)頭痛在低轉(zhuǎn)至較低海拔后8小時(shí)內(nèi)逐漸緩解；(4)頭痛性質(zhì)至少符合以下5項(xiàng)中的2項(xiàng)：a.雙側(cè)頭痛，b.頭痛部位為額部或額顳部，c.疼痛性質(zhì)為鈍痛或壓痛，d.疼痛強(qiáng)度為輕度至中度，e.頭痛強(qiáng)度會(huì)因用力和頭部或身體的運(yùn)動(dòng)而加重(headacheclassification?subcommittee?of?the?international?headache?society.theinternational?classification?of?headache?disorders:2nd?edition.《cephalalgia》，2004.24suppl.1:9-160)。近年來隨著《國(guó)際頭痛分類標(biāo)準(zhǔn)》的更新，hah的診斷也進(jìn)行了更新，依據(jù)ihs制定的第三版《國(guó)際頭痛分類標(biāo)準(zhǔn)》，hah診斷需符合以下條件：(1)頭痛符合標(biāo)準(zhǔn)3；(2)平原人上升至海拔超過2500m處，且至少符合下列3項(xiàng)中的2項(xiàng)：(a)頭痛的發(fā)生與海拔上升在時(shí)間上相關(guān)，(b)符合下列2項(xiàng)中的1項(xiàng)或2項(xiàng)：a)頭痛隨海拔不斷上升而明顯加重，b)脫離高海拔環(huán)境24小時(shí)內(nèi)即可緩解；(3)頭痛至少符合下列3項(xiàng)中的2項(xiàng)：(a)雙側(cè)頭痛，(b)輕至中度頭痛，(c)用力、移動(dòng)、拉伸、咳嗽和/或彎曲運(yùn)動(dòng)會(huì)加重頭痛(headacheclassification?committee?of?the?international?headache?society(ihs).theinternational?classification?of?headache?disorders.3rd?edition,《cephalalgia》，2018:1-211)。由于癥狀強(qiáng)度及癥狀特征存在較大的主觀性，因此尋找更加可靠的客觀性診斷指標(biāo)成為hah診斷的又一研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供與一種用于高原頭痛病輔助診斷的生物標(biāo)志物，以及相關(guān)的應(yīng)用和試劑盒，尤其是通過受檢者唾液中hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p的表達(dá)水平高低診斷高原頭痛病的發(fā)病。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、1.檢測(cè)樣本中microrna表達(dá)量的試劑在制備高原頭痛病的診斷工具中的應(yīng)用，其特征在于，所述microrna為hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p。

4、進(jìn)一步，所述應(yīng)用中hsa-mir-223-5p的序列如seq?id?no.1所示，所述hsa-mir-215-5p的序列如seq?id?no.2所示，所述hsa-mir-23b-3p的序列如seq?id?no.3所示。

5、進(jìn)一步，所述工具包括試劑盒、芯片、試紙、高通量測(cè)序平臺(tái)。

6、進(jìn)一步，所述試劑盒包括針對(duì)microrna的引物和/或探針，所述芯片包括固相載體，以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對(duì)應(yīng)于microrna的部分或全部序列；所述試紙包括針對(duì)microrna的引物和/或探針；所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括針對(duì)microrna的引物和/或探針。

7、進(jìn)一步，所述引物包括檢測(cè)microrna的逆轉(zhuǎn)錄引物、熒光定量反應(yīng)的特異性正向引物以及特異性反向引物。

8、進(jìn)一步，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如seq?id?no.5-seq?id?no.7所示。

9、7.一種高原頭痛病的診斷試劑盒，所述試劑盒包含能夠與各microrna分別特異性結(jié)合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄引物，所述microrna為hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p。

10、進(jìn)一步，所述反轉(zhuǎn)錄引物序列如seq?id?no.5-seq?id?no.7所示。

11、進(jìn)一步，還包括與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異性結(jié)合并進(jìn)行pcr擴(kuò)增的引物。

12、進(jìn)一步，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物序列如seq?id?no.9、seqidno.11、seq?id?no.13所示，反向引物序列如seq?id?no.10、seq?id?no.12、seq?id?no.14所示。

13、進(jìn)一步，所述診斷試劑盒的microrna反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，按每10μl計(jì)，包括：反轉(zhuǎn)錄引物1μl，5x?reverse?transcription?buffer?2μl，rtase?mix?2μl，rnase-free?h2o?3μl，其余2μl為樣本rna。

14、進(jìn)一步，所述診斷試劑盒rt反應(yīng)溫度參數(shù)：42℃60min，70℃10min。

15、進(jìn)一步，所述診斷試劑盒還包括micrornaqpcr反應(yīng)體系，所述micrornaqpcr反應(yīng)體系按每20μl計(jì)包括：sybr?green?mix?10μl，mirnaforward?primer?0.8μl，mirnareverseprimer?0.8μl，ddh2o?6.4μl，其余為rt反應(yīng)產(chǎn)物2μl。

16、進(jìn)一步，所述診斷試劑盒microrna?qpcr反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃10min，變性95℃2s，退火60℃20s，延伸70℃10s。

17、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，找到一種或幾種microrna標(biāo)志物可以有效診斷出是否為hah患者。指導(dǎo)疾病精準(zhǔn)治療和防治，避免因hah疾病的延誤而導(dǎo)致更多風(fēng)險(xiǎn)。

18、本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：檢測(cè)平原人急性進(jìn)入高原后血漿或唾液中hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23b-3p的表達(dá)量，以確定是否診斷為hah患者。

19、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并用另一獨(dú)立人群的急性暴露高原后唾液中循環(huán)microrna表達(dá)水平證實(shí)了血漿或唾液中循環(huán)hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p、hsa-mir-23b-3p或hsa-mir-222-3p等目標(biāo)microrna表達(dá)水平和hah發(fā)病之間存在著相關(guān)性，其表達(dá)水平均上調(diào)，且p＜0.01，即有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？梢詫z測(cè)上述目標(biāo)microrna的表達(dá)量作為制備診斷高原頭痛病癥的試劑或試劑盒應(yīng)用，本發(fā)明的各目標(biāo)microrna作為診斷hah病癥的診斷效能都是很好的，其中hsa-mir-223-5p的診斷效能為0.802，hsa-mir-215-5p的診斷效能為0.780，hsa-mir-23-3p的診斷效能為0.853，以及hsa-mir-222-3p的診斷效能為0.868。進(jìn)一步聯(lián)合hsa-mir-222-3p和hsa-mir-23-3p的診斷效能為0.914；聯(lián)合hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p和hsa-mir-23-3p的診斷效能更是高達(dá)0.940。

20、本發(fā)明提供的各目標(biāo)循環(huán)microrna作為新型的生物標(biāo)志物，具有穩(wěn)定性好、靈敏性和特異性高的特點(diǎn)，新的分子標(biāo)志物的開發(fā)利用將為高原頭痛病的診斷以及進(jìn)一步治療提供新的方向。并且唾液樣品易取得，具有無創(chuàng)性。研究證實(shí)了hsa-mir-223-5p、hsa-mir-215-5p、hsa-mir-23b-3p或hsa-mir-222-3p獨(dú)立或者聯(lián)合作為診斷高原頭痛病的無創(chuàng)標(biāo)記物的可靠性，診斷效能更為精準(zhǔn)，可以客觀性診斷急進(jìn)高原人群是否為hah患者，對(duì)高原頭痛病癥的臨床診斷和靶向治療提供參考價(jià)值，從一定程度上避免了主觀性人為判斷的誤差；精準(zhǔn)指導(dǎo)疾病防治，減輕平原人進(jìn)入高原后的疾病風(fēng)險(xiǎn)。