本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，具體涉及一種基于結(jié)縷草基因組序列開(kāi)發(fā)的ssr標(biāo)記引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、結(jié)縷草(zoysia?willd.)，為禾本科，屬于多年生草本植物。不同的結(jié)縷草種質(zhì)資源在環(huán)境適應(yīng)性、抗逆性、飼用性能等特性上差異明顯。我國(guó)結(jié)縷草分布范圍較廣，適應(yīng)性強(qiáng)，可在荒漠以及鹽堿地等環(huán)境中生長(zhǎng)，是世界上公認(rèn)的優(yōu)良的暖季型草坪草。

2、搞清楚物種的遺傳多樣性及遺傳背景是合理保護(hù)利用該資源的前提，分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是研究物質(zhì)遺傳多樣性及遺傳背景的強(qiáng)大工具。雖然rapd、issr、srap等分子標(biāo)記技術(shù)已在結(jié)縷草遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜和遺傳背景等方面得到了一些應(yīng)用，但有關(guān)結(jié)縷草特異引物的報(bào)道較少，導(dǎo)致在研究結(jié)縷草遺傳多樣性和結(jié)縷草遺傳背景上的困難較大，育種進(jìn)程緩慢。因此，豐富結(jié)縷草特異引物庫(kù)已成為當(dāng)務(wù)之急。

3、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(ssr，simple?sequence?repeat)又稱為微衛(wèi)星dna，是以2～6個(gè)核苷酸為基本單位的串聯(lián)重復(fù)序列組成的dna片段，長(zhǎng)度大多為100～200個(gè)堿基對(duì)，具有分布廣泛，多態(tài)性豐富，重復(fù)性好，共顯性遺傳等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性及遺傳背景研究、品種鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等方面，是分子標(biāo)記輔助育種首選標(biāo)記之一。基因組測(cè)序(dna-seq)技術(shù)是利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)組織或者細(xì)胞中的dna進(jìn)行深度測(cè)序的技術(shù)，是一種在基因組水平上高通量、低成本分析基因表達(dá)差異的有效手段，高效率、高通量、低成本地獲得大量的轉(zhuǎn)錄本信息的主要手段。目前尚未見(jiàn)到利用基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)結(jié)縷草ssr標(biāo)記的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于結(jié)縷草基因組序列開(kāi)發(fā)的ssr標(biāo)記引物和對(duì)結(jié)縷草親緣關(guān)系的研究方法和品種的鑒定方法。

2、本發(fā)明提供了一種鑒定結(jié)縷草的ssr標(biāo)記組合，所述ssr標(biāo)記組合包括ssr01、ssr02、ssr03、ssr04、ssr05、ssr06、ssr07、ssr08、ssr09、ssr10、ssr11、ssr12、ssr13、ssr14、ssr15、ssr16、ssr17、ssr18、ssr19、ssr20、ssr21、ssr22、ssr23、ssr24、ssr25、ssr26、ssr27、ssr28、ssr29、ssr30、ssr31、ssr32、ssr33、ssr34、ssr35、ssr36、ssr37、ssr38和ssr39；

3、所述ssr01的重復(fù)單元為gcc，重復(fù)次數(shù)為5；

4、所述ssr02的重復(fù)單元為gga，重復(fù)次數(shù)為6；

5、所述ssr03的重復(fù)單元為gag，重復(fù)次數(shù)為6；

6、所述ssr04的重復(fù)單元為cct，重復(fù)次數(shù)為5；

7、所述ssr05的重復(fù)單元為ggt，重復(fù)次數(shù)為7；

8、所述ssr06的重復(fù)單元為gcg，重復(fù)次數(shù)為10；

9、所述ssr07的重復(fù)單元為gaa，重復(fù)次數(shù)為5；

10、所述ssr08的重復(fù)單元為gga，重復(fù)次數(shù)為7；

11、所述ssr09的重復(fù)單元為tgt，重復(fù)次數(shù)為7；

12、所述ssr10的重復(fù)單元為ctc，重復(fù)次數(shù)為8；

13、所述ssr11的重復(fù)單元為gag，重復(fù)次數(shù)為5；

14、所述ssr12的重復(fù)單元為ttc，重復(fù)次數(shù)為5；

15、所述ssr13的重復(fù)單元為cgc，重復(fù)次數(shù)為5；

16、所述ssr14的重復(fù)單元為tca，重復(fù)次數(shù)為8；

17、所述ssr15的重復(fù)單元為ggc，重復(fù)次數(shù)為7；

18、所述ssr16的重復(fù)單元為gcg，重復(fù)次數(shù)為7；

19、所述ssr17的重復(fù)單元為cgc，重復(fù)次數(shù)為5；

20、所述ssr18的重復(fù)單元為ctg，重復(fù)次數(shù)為7；

21、所述ssr19的重復(fù)單元為gca，重復(fù)次數(shù)為6；

22、所述ssr20的重復(fù)單元為ct，重復(fù)次數(shù)為22；

23、所述ssr21的重復(fù)單元為gag，重復(fù)次數(shù)為7；

24、所述ssr22的重復(fù)單元為agc，重復(fù)次數(shù)為5；

25、所述ssr23的重復(fù)單元為cca，重復(fù)次數(shù)為6；

26、所述ssr24的重復(fù)單元為ggc，重復(fù)次數(shù)為6；

27、所述ssr25的重復(fù)單元為gcg，重復(fù)次數(shù)為8；

28、所述ssr26的重復(fù)單元為tgc，重復(fù)次數(shù)為5；

29、所述ssr27的重復(fù)單元為cct，重復(fù)次數(shù)為5；

30、所述ssr28的重復(fù)單元為tc，重復(fù)次數(shù)為8；

31、所述ssr29的重復(fù)單元為gtg，重復(fù)次數(shù)為6；

32、所述ssr30的重復(fù)單元為gcc，重復(fù)次數(shù)為5；

33、所述ssr31的重復(fù)單元為gac，重復(fù)次數(shù)為7；

34、所述ssr32的重復(fù)單元為ccg，重復(fù)次數(shù)為5；

35、所述ssr33的重復(fù)單元為tac，重復(fù)次數(shù)為8；

36、所述ssr34的重復(fù)單元為cgg，重復(fù)次數(shù)為6；

37、所述ssr35的重復(fù)單元為tcagc，重復(fù)次數(shù)為5；

38、所述ssr36的重復(fù)單元為cctcag，重復(fù)次數(shù)為5；

39、所述ssr37的重復(fù)單元為tga，重復(fù)次數(shù)為5；

40、所述ssr38的重復(fù)單元為cgg，重復(fù)次數(shù)為5；

41、所述ssr39的重復(fù)單元為agg，重復(fù)次數(shù)為5。

42、本發(fā)明還提供了一組用于擴(kuò)增上述技術(shù)方案所述ssr標(biāo)記組合的引物組合，包括zj-ssr01、zj-ssr02、zj-ssr03、zj-ssr04、zj-ssr05、zj-ssr06、zj-ssr07、zj-ssr08、zj-ssr09、zj-ssr10、zj-ssr11、zj-ssr12、zj-ssr13、zj-ssr14、zj-ssr15、zj-ssr16、zj-ssr17、zj-ssr18、zj-ssr19、zj-ssr20、zj-ssr21、zj-ssr22、zj-ssr23、zj-ssr24、zj-ssr25、zj-ssr26、zj-ssr27、zj-ssr28、zj-ssr29、zj-ssr30、zj-ssr31、zj-ssr32、zj-ssr33、zj-ssr34、zj-ssr35、zj-ssr36、zj-ssr37、zj-ssr38和zj-ssr39；

43、所述zj-ssr01包括zj-ssr01-f和zj-ssr01-r，所述zj-ssr01-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述zj-ssr01-r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

44、所述zj-ssr02包括zj-ssr02-f和zj-ssr02-r，所述zj-ssr02-f的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述zj-ssr01-r的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

45、所述zj-ssr03包括zj-ssr03-f和zj-ssr03-r，所述zj-ssr03-f的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，所述zj-ssr03-r的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

46、所述zj-ssr04包括zj-ssr04-f和zj-ssr04-r，所述zj-ssr04-f的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述zj-ssr04-r的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；

47、所述zj-ssr05包括zj-ssr05-f和zj-ssr05-r，所述zj-ssr05-f的核苷酸序列如seq?id?no.9所示，所述zj-ssr05-r的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；

48、所述zj-ssr06包括zj-ssr06-f和zj-ssr01-r，所述zj-ssr06-f的核苷酸序列如seq?id?no.11所示，所述zj-ssr06-r的核苷酸序列如seq?id?no.12所示；

49、所述zj-ssr07包括zj-ssr07-f和zj-ssr07-r，所述zj-ssr07-f的核苷酸序列如seq?id?no.13所示，所述zj-ssr07-r的核苷酸序列如seq?id?no.14所示；

50、所述zj-ssr08包括zj-ssr08-f和zj-ssr08-r，所述zj-ssr08-f的核苷酸序列如seq?id?no.15所示，所述zj-ssr08-r的核苷酸序列如seq?id?no.16所示；

51、所述、zj-ssr09包括zj-ssr09-f和zj-ssr09-r，所述zj-ssr09-f的核苷酸序列如seq?id?no.17所示，所述zj-ssr09-r的核苷酸序列如seq?id?no.18所示；

52、所述zj-ssr10包括zj-ssr10-f和zj-ssr10-r，所述zj-ssr10-f的核苷酸序列如seq?id?no.19所示，所述zj-ssr10-r的核苷酸序列如seq?id?no.20所示；

53、所述zj-ssr11包括zj-ssr11-f和zj-ssr11-r，所述zj-ssr11-f的核苷酸序列如seq?id?no.21所示，所述zj-ssr11-r的核苷酸序列如seq?id?no.22所示；

54、所述zj-ssr12包括zj-ssr12-f和zj-ssr12-r，所述zj-ssr12-f的核苷酸序列如seq?id?no.23所示，所述zj-ssr12-r的核苷酸序列如seq?id?no.24所示；

55、所述zj-ssr13包括zj-ssr13-f和zj-ssr13-r，所述zj-ssr14-f的核苷酸序列如seq?id?no.25所示，所述zj-ssr14-r的核苷酸序列如seq?id?no.26所示；

56、所述zj-ssr14包括zj-ssr14-f和zj-ssr14-r，所述zj-ssr14-f的核苷酸序列如seq?id?no.27所示，所述zj-ssr14-r的核苷酸序列如seq?id?no.28所示；

57、所述zj-ssr15包括zj-ssr15-f和zj-ssr15-r，所述zj-ssr15-f的核苷酸序列如seq?id?no.29所示，所述zj-ssr15-r的核苷酸序列如seq?id?no.30所示；

58、所述zj-ssr16包括zj-ssr16-f和zj-ssr16-r，所述zj-ssr16-f的核苷酸序列如seq?id?no.31所示，所述zj-ssr16-r的核苷酸序列如seq?id?no.32所示；

59、所述zj-ssr17包括zj-ssr17-f和zj-ssr17-r，所述zj-ssr17-f的核苷酸序列如seq?id?no.33所示，所述zj-ssr17-r的核苷酸序列如seq?id?no.34所示；

60、所述zj-ssr18包括zj-ssr18-f和zj-ssr18-r，所述zj-ssr18-f的核苷酸序列如seq?id?no.35所示，所述zj-ssr18-r的核苷酸序列如seq?id?no.36所示；

61、所述zj-ssr19包括zj-ssr19-f和zj-ssr19-r，所述zj-ssr19-f的核苷酸序列如seq?id?no.37所示，所述zj-ssr19-r的核苷酸序列如seq?id?no.38所示；

62、所述zj-ssr20包括zj-ssr20-f和zj-ssr20-r，所述zj-ssr20-f的核苷酸序列如seq?id?no.39所示，所述zj-ssr20-r的核苷酸序列如seq?id?no.40所示；

63、所述zj-ssr21包括zj-ssr21-f和zj-ssr21-r，所述zj-ssr21-f的核苷酸序列如seq?id?no.41所示，所述zj-ssr21-r的核苷酸序列如seq?id?no.42所示；

64、所述zj-ssr22包括zj-ssr22-f和zj-ssr22-r，所述zj-ssr22-f的核苷酸序列如seq?id?no.43所示，所述zj-ssr22-r的核苷酸序列如seq?id?no.44所示；

65、所述zj-ssr23包括zj-ssr23-f和zj-ssr23-r，所述zj-ssr23-f的核苷酸序列如seq?id?no.45所示，所述zj-ssr23-r的核苷酸序列如seq?id?no.46所示；

66、所述zj-ssr24包括zj-ssr24-f和zj-ssr24-r，所述zj-ssr24-f的核苷酸序列如seq?id?no.47所示，所述zj-ssr24-r的核苷酸序列如seq?id?no.48所示；

67、所述zj-ssr25包括zj-ssr25-f和zj-ssr25-r，所述zj-ssr25-f的核苷酸序列如seq?id?no.49所示，所述zj-ssr25-r的核苷酸序列如seq?id?no.50所示；

68、所述zj-ssr26包括zj-ssr26-f和zj-ssr26-r，所述zj-ssr26-f的核苷酸序列如seq?id?no.51所示，所述zj-ssr21-r的核苷酸序列如seq?id?no.52所示；

69、所述zj-ssr27包括zj-ssr27-f和zj-ssr27-r，所述zj-ssr27-f的核苷酸序列如seq?id?no.53所示，所述zj-ssr27-r的核苷酸序列如seq?id?no.54所示；

70、所述zj-ssr28包括zj-ssr28-f和zj-ssr28-r，所述zj-ssr28-f的核苷酸序列如seq?id?no.55所示，所述zj-ssr28-r的核苷酸序列如seq?id?no.56所示；

71、所述zj-ssr29包括zj-ssr29-f和zj-ssr29-r，所述zj-ssr29-f的核苷酸序列如seq?id?no.57所示，所述zj-ssr29-r的核苷酸序列如seq?id?no.58所示；

72、所述zj-ssr30包括zj-ssr30-f和zj-ssr30-r，所述zj-ssr30-f的核苷酸序列如seq?id?no.59所示，所述zj-ssr30-r的核苷酸序列如seq?id?no.60所示；

73、所述zj-ssr31包括zj-ssr31-f和zj-ssr31-r，所述zj-ssr31-f的核苷酸序列如seq?id?no.61所示，所述zj-ssr31-r的核苷酸序列如seq?id?no.62所示；

74、所述zj-ssr32包括zj-ssr32-f和zj-ssr32-r，所述zj-ssr32-f的核苷酸序列如seq?id?no.63所示，所述zj-ssr32-r的核苷酸序列如seq?id?no.64所示；

75、所述zj-ssr33包括zj-ssr33-f和zj-ssr33-r，所述zj-ssr33-f的核苷酸序列如seq?id?no.65所示，所述zj-ssr33-r的核苷酸序列如seq?id?no.66所示；

76、所述zj-ssr34包括zj-ssr34-f和zj-ssr34-r，所述zj-ssr34-f的核苷酸序列如seq?id?no.67所示，所述zj-ssr34-r的核苷酸序列如seq?id?no.68所示；

77、所述zj-ssr35包括zj-ssr35-f和zj-ssr35-r，所述zj-ssr35-f的核苷酸序列如seq?id?no.69所示，所述zj-ssr35-r的核苷酸序列如seq?id?no.70所示；

78、所述zj-ssr36包括zj-ssr36-f和zj-ssr36-r，所述zj-ssr36-f的核苷酸序列如seq?id?no.71所示，所述zj-ssr36-r的核苷酸序列如seq?id?no.72所示；

79、所述zj-ssr37包括zj-ssr37-f和zj-ssr37-r，所述zj-ssr37-f的核苷酸序列如seq?id?no.73所示，所述zj-ssr37-r的核苷酸序列如seq?id?no.74所示；

80、所述zj-ssr38包括zj-ssr38-f和zj-ssr38-r，所述zj-ssr38-f的核苷酸序列如seq?id?no.75所示，所述zj-ssr38-r的核苷酸序列如seq?id?no.76所示；

81、所述zj-ssr39包括zj-ssr39-f和zj-ssr39-r，所述zj-ssr39-f的核苷酸序列如seq?id?no.77所示，所述zj-ssr39-r的核苷酸序列如seq?id?no.78所示。

82、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述ssr標(biāo)記組合或上述技術(shù)方案所述引物組合在鑒定和/或區(qū)分結(jié)縷草品種中的應(yīng)用。

83、本發(fā)明還提供了一種結(jié)縷草品種的鑒定方法，包括如下步驟：

84、提取結(jié)縷草基因組dna；使用上述技術(shù)方案所述的引物組合對(duì)所述結(jié)縷草基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；將pcr產(chǎn)物進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳；對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析。

85、本發(fā)明還提供了一種鑒定結(jié)縷草品種的試劑盒，所述試劑盒包括上述技術(shù)方案所述的引物組合。

86、本發(fā)明還提供了一種結(jié)縷草基因組芯片，所述結(jié)縷草基因組芯片含有上述技術(shù)方案所述ssr標(biāo)記組合。

87、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述ssr標(biāo)記組合或上述技術(shù)方案所述引物組合或上述技術(shù)方案所述試劑盒或上述技術(shù)方案所述的結(jié)縷草基因組芯片在結(jié)縷草的親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用。

88、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述ssr標(biāo)記組合或上述技術(shù)方案所述引物組合或上述技術(shù)方案所述試劑盒或上述技術(shù)方案所述的結(jié)縷草基因組芯片在結(jié)縷草的母系溯源中的應(yīng)用。

89、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述ssr標(biāo)記組合或上述技術(shù)方案所述引物組合或上述技術(shù)方案所述試劑盒或上述技術(shù)方案所述的結(jié)縷草基因組芯片在結(jié)縷草遺傳譜系分析和/或遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用。

90、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述ssr標(biāo)記組合或上述技術(shù)方案所述引物組合或上述技術(shù)方案所述試劑盒或上述技術(shù)方案所述的結(jié)縷草基因組芯片在結(jié)縷草種質(zhì)資源的保護(hù)和/或輔助育種中的應(yīng)用。

91、有益效果：

92、本發(fā)明提供了一種鑒定結(jié)縷草的ssr標(biāo)記組合，采用本發(fā)明提供的ssr標(biāo)記組合對(duì)36份結(jié)縷草材料鑒定后可以確定它們之間的親緣關(guān)系，對(duì)不同材料進(jìn)行區(qū)分，可以為未知新品種與已知品種之間的親緣關(guān)系分析和新品種鑒定提供技術(shù)支持。

93、本發(fā)明提供的ssr標(biāo)記引物來(lái)自于結(jié)縷草基因組序列，引物的多態(tài)性豐富、擴(kuò)增穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶易于鑒定，是穩(wěn)定存在的新標(biāo)記，填補(bǔ)了結(jié)縷草基于基因組開(kāi)發(fā)ssr引物的空白。