本發(fā)明涉及杜鵑花屬分子標(biāo)記，尤其是涉及杜鵑花屬ssr分子標(biāo)記、引物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、杜鵑花是杜鵑花科(ericaceae)杜鵑花屬(rhododendron)植物的統(tǒng)稱，常綠或落葉灌木，有較強(qiáng)的鑒賞性，常用作園林內(nèi)綠化植物。杜鵑花的食用及藥用價值較高，且在保水固土、維護(hù)生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用，在我國有悠久的種植歷史。杜鵑屬是杜鵑花科中最大的屬，全世界有1200余種，全球杜鵑花品種已經(jīng)超過3萬個，廣泛分布于亞洲、北美洲、歐洲，其中90％以上的種集中分布于亞洲東部，中國是野生杜鵑花資源最豐富的國家。杜鵑花多通過雜交育種開發(fā)新品種，但由于目前其分類體系不夠完善、親緣關(guān)系混亂不清，致使育種工作阻礙重重。

2、簡單序列重復(fù)(ssr,simple?sequence?repeat)，亦被稱作微衛(wèi)星(microsatellite)，為基因組中由大約1-6個核苷酸組合而成的基本單位進(jìn)行多次重復(fù)從而構(gòu)成的一段dna序列。ssr分子標(biāo)記以其共顯性遺傳、所需dna用量少、操作簡單、數(shù)量豐富、種屬間具有很強(qiáng)的通用性和多態(tài)性、實驗重復(fù)性好等優(yōu)點。tpm13-ssr(simple?sequencerepeat?with?tailed?primer?m13)技術(shù)結(jié)合了ssr分子標(biāo)記技術(shù)和熒光測序技術(shù)，具有重復(fù)性高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，在較大程度上解決了傳統(tǒng)凝膠電泳分析通量較低、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測流程繁瑣、數(shù)據(jù)記錄工作量大等一系列問題。

3、近年來，ssr分子標(biāo)記在杜鵑花屬中的應(yīng)用研究大幅增加，但由于杜鵑花屬基因組序列的挖掘尚不完全，從ncbi數(shù)據(jù)庫中可搜索到杜鵑花屬公開發(fā)表的基因組數(shù)據(jù)極為有限，只有10個物種(包括靈寶杜鵑r.henanense、白花杜鵑r.mucronatum、杜鵑r.simsii、朱紅大杜鵑r.griersonianum、紅馬銀花r.vialii、羊躑躅r.molle、馬銀花r.ovatum、歐洲杜鵑r.ferrugineum、r.kiyosumense、圓葉杜鵑r.williamsianum)的基因組數(shù)據(jù)被公開，占整個杜鵑花屬物種數(shù)量的0.8％，可供研究使用數(shù)據(jù)非常貧乏。在該情況下，利用ssr進(jìn)行研究有其意義，ssr標(biāo)記能夠在一定程度上彌補(bǔ)基因組數(shù)據(jù)不足的限制，在遺傳多樣性、基因定位及分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖構(gòu)建等方面具有較高的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供杜鵑花屬ssr分子標(biāo)記、引物組合物及其應(yīng)用，以在目前杜鵑花屬基因組數(shù)據(jù)有限、基因挖掘尚不完全情況下，為杜鵑花屬種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性研究、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建提供擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的分子標(biāo)記。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供杜鵑花屬ssr分子標(biāo)記，共30個，其中6個的重復(fù)單元為二堿基，24個為三堿基，分別為a-001、a-016、a-018、a-022、a-049、a-052、a-254、a-260、a-264、a-267、a-272、a-290、a-300、a-313、a-321、aa-334、a-335、a-336、a-341、a-345、a-346、a-349、a-350、a-353、a-354、a-356、a-362、a-363、a-368、a-394。

3、優(yōu)選地，a-001的重復(fù)單元為ta，重復(fù)次數(shù)為8；a-016的重復(fù)單元為tc，重復(fù)次數(shù)為8；a-018的重復(fù)單元為ca，重復(fù)次數(shù)為9；a-022的重復(fù)單元為ag，重復(fù)次數(shù)為9；a-049的重復(fù)單元為at，重復(fù)次數(shù)為8；a-052的重復(fù)單元為ct，重復(fù)次數(shù)為8；a-254的重復(fù)單元為ccg，重復(fù)次數(shù)為5；a-260的重復(fù)單元為acc，重復(fù)次數(shù)為5；a-264的重復(fù)單元為ggt，重復(fù)次數(shù)為5；a-267的重復(fù)單元為gga，重復(fù)次數(shù)為6；a-272的重復(fù)單元為aga，重復(fù)次數(shù)為5；a-290的重復(fù)單元為gaa，重復(fù)次數(shù)為5；a-300的重復(fù)單元為cga，重復(fù)次數(shù)為7；a-313的重復(fù)單元為gac，重復(fù)次數(shù)為5；a-321的重復(fù)單元為ctt，重復(fù)次數(shù)為7；a-334的重復(fù)單元為atg，重復(fù)次數(shù)為5；a-335的重復(fù)單元為gct，重復(fù)次數(shù)為5；a-336的重復(fù)單元為tct，重復(fù)次數(shù)為5；a-341的重復(fù)單元為gcg，重復(fù)次數(shù)為5；a-345的重復(fù)單元為cct，重復(fù)次數(shù)為7；a-346的重復(fù)單元為gaa，重復(fù)次數(shù)為5；a-349的重復(fù)單元為gaa，重復(fù)次數(shù)為5；a-350的重復(fù)單元為cct，重復(fù)次數(shù)為5；a-353的重復(fù)單元為cac，重復(fù)次數(shù)為5；a-354的重復(fù)單元為tct，重復(fù)次數(shù)為5；a-356的重復(fù)單元為gcg，重復(fù)次數(shù)為5；a-362的重復(fù)單元為tcc，重復(fù)次數(shù)為5；a-363的重復(fù)單元為ttc，重復(fù)次數(shù)為5；a-368的重復(fù)單元為gtg，重復(fù)次數(shù)為5；a-394的重復(fù)單元為cag，重復(fù)次數(shù)為5。

4、優(yōu)選地，a-001的正向引物序列如seq?id?no.1所示，反向引物的序列如seq?idno.2所示；a-016的正向引物序列如seq?id?no.3所示，反向引物的序列如seq?id?no.4所示；a-018的正向引物序列如seq?id?no.5所示，反向引物的序列如seq?id?no.6所示；a-022的正向引物序列如seq?id?no.7所示，反向引物的序列如seq?id?no.8所示；a-049的正向引物序列如seq?id?no.9所示，反向引物的序列如seq?id?no.10所示；a-052的正向引物序列如seq?id?no.11所示，反向引物的序列如seq?id?no.12所示；a-254的正向引物序列如seqid?no.13所示，反向引物的序列如seq?id?no.14所示；a-260的正向引物序列如seq?idno.15所示，反向引物的序列如seq?id?no.16所示；a-264的正向引物序列如seq?id?no.17所示，反向引物的序列如seq?id?no.18所示；a-267的正向引物序列如seq?id?no.19所示，反向引物的序列如seq?id?no.20所示；a-272的正向引物序列如seq?id?no.21所示，反向引物的序列如seq?id?no.22所示；a-290的正向引物序列如seq?id?no.23所示，反向引物的序列如seq?id?no.24所示；a-300的正向引物序列如seq?id?no.25所示，反向引物的序列如seq?id?no.26所示；a-313的正向引物序列如seq?id?no.27所示，反向引物的序列如seq?idno.28所示；a-321的正向引物序列如seq?id?no.29所示，反向引物的序列如seq?id?no.30所示；aa-334的正向引物序列如seq?id?no.31所示，反向引物的序列如seq?id?no.32所示；a-335的正向引物序列如seq?id?no.33所示，反向引物的序列如seq?id?no.34所示；a-336的正向引物序列如seq?id?no.35所示，反向引物的序列如seq?id?no.36所示；a-341的正向引物序列如seq?id?no.37所示，反向引物的序列如seq?id?no.38所示；a-345的正向引物序列如seq?id?no.39所示，反向引物的序列如seq?id?no.40所示；a-346的正向引物序列如seq?id?no.41所示，反向引物的序列如seq?id?no.42所示；a-349的正向引物序列如seq?idno.43所示，反向引物的序列如seq?id?no.44所示；a-350的正向引物序列如seq?id?no.45所示，反向引物的序列如seq?id?no.46所示；a-353的正向引物序列如seq?id?no.47所示，反向引物的序列如seq?id?no.48所示；a-354的正向引物序列如seq?id?no.49所示，反向引物的序列如seq?id?no.50所示；a-356的正向引物序列如seq?id?no.51所示，反向引物的序列如seq?id?no.52所示；a-362的正向引物序列如seq?id?no.53所示，反向引物的序列如seq?id?no.54所示；a-363的正向引物序列如seq?id?no.55所示，反向引物的序列如seq?idno.56所示；a-368的正向引物序列如seq?id?no.57所示，反向引物的序列如seq?id?no.58所示；a-394的正向引物序列如seq?id?no.59所示，反向引物的序列如seq?id?no.60所示。

5、一種杜鵑花屬種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性或親緣關(guān)系分析的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品為試劑或試劑盒，所述產(chǎn)品中包含上述ssr分子標(biāo)記。

6、一種如上所述的產(chǎn)品在杜鵑花屬種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用。

7、如上所述的杜鵑花屬ssr分子標(biāo)記在杜鵑花屬種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用。

8、如上所述的杜鵑花屬ssr分子標(biāo)記在杜鵑花屬種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析中的使用方法，正向引物5′端加不帶熒光標(biāo)記的m13接頭，反向引物不變，再用一條帶有熒光基團(tuán)的m13引物，總共三條引物對待分析樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳檢測，根據(jù)獲得的峰圖和參數(shù)，將片段數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為“0”、“1”矩陣，利用ntsys-pc軟件計算ssr位點的dice相似系數(shù)并進(jìn)行非加權(quán)組類平均法聚類分析，確定親緣關(guān)系和種質(zhì)。

9、優(yōu)選地，m13接頭/引物的序列如seq?id?no.61所示，熒光基團(tuán)為fam、hex、tamrad和rox中的一種。

10、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增程序為94℃，3min；94℃，94℃，30s；56℃，30s，72℃，1min，35個循環(huán)；72℃，10min。

11、因此，本發(fā)明提供的杜鵑花屬ssr分子標(biāo)記、引物組合物及其應(yīng)用，其具體技術(shù)效果如下：

12、(1)本發(fā)明提供的ssr及引物組合物，在杜鵑花各品種中擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好，可準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定地鑒定杜鵑花種質(zhì)資源，操作簡便；

13、(2)本發(fā)明提供的ssr及引物組合物，能夠用于杜鵑花各亞屬間種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，結(jié)果穩(wěn)定可靠，為杜鵑花屬種質(zhì)資源管理、育種、遺傳保護(hù)、杜鵑花群體間和群體內(nèi)的遺傳多樣性分析等奠定了基礎(chǔ)；

14、(3)本發(fā)明提供的ssr及引物組合物，能夠很好地區(qū)分各個野生種，可以用于不同亞屬的遺傳分析和分類研究。

15、下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。