本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種全細胞催化生產(chǎn)多巴胺的基因工程重組菌及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

1、多巴胺(dopamine)是最簡單的兒茶酚胺類藥物，其可激動交感神經(jīng)系統(tǒng)腎上腺素受體和位于腎腎臟、腸系膜、冠狀動脈、腦動脈的多巴胺受體。廣泛用于急性心肌梗死、充血性心力衰竭、創(chuàng)傷、內(nèi)毒素敗血癥、各類高危手術(shù)等引起的休克綜合癥，有效的提升了各類危急重癥患者的生存率。多巴胺也是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，多巴胺系統(tǒng)分泌及調(diào)節(jié)障礙會導致帕金森病、精神分裂癥、tourette綜合癥、注意力缺陷多動綜合癥、垂體腫瘤等病癥的發(fā)生。同時，多巴胺在一定條件下能夠形成聚合物，作為新型的可降解生物相容性材料在生物醫(yī)學等領域也有廣泛應用。另外，在生物體內(nèi)，以多巴胺為底物，經(jīng)過β-羥化和n-甲基化修飾，可進一步合成另外兩種臨床應用廣泛的兒茶酚胺類藥物：去甲腎上腺素和腎上腺素。

2、根據(jù)目前研究報道，具有經(jīng)濟和應用價值的鹽酸多巴胺原料藥只能通過化學合成的方法獲得。該合成方法具有多種缺點：(1)合成步驟繁瑣，回收率低：其以香蘭素為起始原料，經(jīng)過縮合、還原和成鹽等眾多步驟后，多巴胺的收率僅為50％。(2)合成工序缺乏綠色環(huán)保：還原工序中以鋅汞齊作還原劑，毒性大，制備難；去甲基工序中采用氫碘酸法制成多巴胺鹽，氫碘酸具有很強的酸性及腐蝕性；反應過程中以甲醇作為溶劑，該試劑易燃易爆且毒性較大；(3)合成工序經(jīng)濟效益低：其原料香蘭素價格較高，并且合成過程回收率低，進而造成多巴胺原料藥價格昂貴，每噸原料藥價格超過1000萬人民幣。

3、多巴胺生物合成報道少，研究淺。das等人(das?a,verma?a,mukherjee?kj.synthesis?of?dopamine?in?e.coli?using?plasmid-based?expression?system?andits?marked?eff?ect?on?host?growth?profiles[j].preparative?biochemistry?andbiotechnology,2017,47(8):754-760.)在大腸桿菌dh5α中以質(zhì)粒形式過表達4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶(hpabc)和來源于野豬(susscrofa)的左旋多巴脫羧酶(ssddc)，通過喂養(yǎng)底物酪氨酸，搖瓶培養(yǎng)24h，多巴胺產(chǎn)量僅為27mg/l。nakagawa等人(nakagawaa,matsuzaki?c,matsumurae,et?al.(r,s)-tetrahydropapaveroline?production?by?stepwisefermentation?using?engineered?escherichia?coli[j].scientific?reports,2014,4(1):6695.)在大腸桿菌bl21(de3)菌株中刪除ty?rr基因，通過pcoladuet-1和pet23a的雙質(zhì)粒過表達多巴胺合成途徑關鍵基因tyrafbr、ar?ogfbr、tkta、ppsa、rstyr和dodc，獲得的工程菌株可以利用978mm甘油(90g/l)合成14mm(2.15g/l)多巴胺。kurt等人(kurt?ag,aytane,ozer?u,et?al.production?of?l-dopaand?dopamine?in?recombinant?bacteriabearing?the?vitreoscilla?hemoglobin?gene[j].biotechnology?journal:healthcarenutrition?technology,2009,4(7):1077-1088.)在弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)和赫氏歐文氏菌(erwiniaherbicola)中表達來自于透明顫菌的血紅蛋白增強氧氣供應，通過喂養(yǎng)底物酪氨酸的方式培養(yǎng)24h，菌體內(nèi)能夠合成微量的多巴胺。lee等人(lee?s,hong?s,sung?m.development?of?an?enzymatic?system?for?theproduction?of?dopamine?from?catechol,pyruvate,and?ammonia[j].enzyme?andmicrobial?te?chnology,1999,25(3-5):298-302.)組合使用純化的酪氨酸苯酚裂解酶和酪氨酸脫羧酶為生物催化劑，以兒茶酚、丙酮酸和氯化銨為原料，催化10h得到8mm的多巴胺。

4、由此可見，利用微生物合成多巴胺的效率仍然較低，難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本發(fā)明公開的生產(chǎn)方法可以有效解決多巴胺合成效率低的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種高效全細胞催化生產(chǎn)多巴胺的方法及所用到的基因工程重組菌。

2、本發(fā)明提供一種用于全細胞催化生產(chǎn)多巴胺的基因工程重組菌，其特征在于，所述基因工程重組菌是通過在宿主細胞中表達脫羧酶基因而獲得，優(yōu)選地，所述宿主細胞為大腸桿菌(escherichia?coli)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)或需鈉弧菌(vibrio?natriegens)。

3、優(yōu)選地，所述宿主細胞為大腸桿菌bl21(de3)或bl21(de3)plyss或rosetta(de3)或rosetta(de3)plyss或origami中的任意一種菌株作為宿主細胞。

4、另外優(yōu)選地，所述脫羧酶基因的ncbi登錄號為kaf6152535.1、aaa62346.1、aaa62347.1、aaa33860.1、aaa33109.1或aaa58437.1。

5、更具體地，所述脫羧酶基因的核苷酸序列如seq?id?no：1-6。

6、本發(fā)明提供一種構(gòu)建用于全細胞催化生產(chǎn)多巴胺的基因工程重組菌的方法，其通過在出發(fā)宿主細胞中表達脫羧酶基因而獲得所述基因工程重組菌。

7、具體實施方式中，所述脫羧酶基因連接至pet30a或pet28a或pet26b中任意一種表達載體上導入宿主細胞而實現(xiàn)表達；

8、本發(fā)明還提供一種催化生產(chǎn)多巴胺的全細胞催化劑，其是培養(yǎng)所述基因工程重組菌并表達脫羧酶基因，得到全細胞催化劑；具體地，利用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷或乳糖誘導脫羧酶基因表達，獲得全細胞催化劑。

9、本發(fā)明提供一種全細胞催化生產(chǎn)多巴胺的方法，其采用所述的基因工程重組菌，或所述的全細胞催化劑，以左旋多巴作為底物，全細胞催化合成多巴胺。

10、在具體實施方式中，所述全細胞催化的體系中左旋多巴濃度為10-100g/l，全細胞催化劑用量為1-100od600；所述全細胞催化體系的反應體系為m9培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、tris-hcl緩沖液、乙酸鹽緩沖液中的任意一種。

11、優(yōu)選地，所述反應體系的ph為5-8；反應溫度為20-40℃；反應時間為0.5-24h；所述左旋多巴為純品或者由微生物發(fā)酵獲得的左旋多巴發(fā)酵液。

12、本發(fā)明的優(yōu)點在于通過上述技術(shù)方案最終提供了一種將左旋多巴高效全細胞催化合成多巴胺的生產(chǎn)方法，利用一種脫羧酶的基因工程重組菌作為全細胞催化劑，將左旋多巴高效催化轉(zhuǎn)化為多巴胺，整個催化過程中無需添加輔因子nadp+。本發(fā)明提供的全細胞催化生產(chǎn)多巴胺的方法具有合成效率高、無需添加輔因子、操作簡單的特點，具有重要的工業(yè)應用價值。