本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域，具體地，涉及一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv亞型的檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率呈穩(wěn)定上升趨勢，國際癌癥研究中心預(yù)計(jì)到2030年新增病例數(shù)將增至93500例，到2050年將達(dá)到186600例。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染被確定為宮頸癌的原因之一，宮頸癌的發(fā)生中有80％與hpv的感染有關(guān)。宮頸癌致病因素明確，降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在很大程度上取決于宮頸癌的早期篩查；因此，提升宮頸癌的早篩技術(shù)并廣泛普及應(yīng)用對宮頸癌的預(yù)防或診療具有重要的臨床意義。

2、現(xiàn)有技術(shù)中，臨床上宮頸癌初篩的常規(guī)方法主要是hpv檢測和細(xì)胞學(xué)檢測。檢測hpv分型的常用技術(shù)為流式熒光雜交核酸分型檢測技術(shù)，該技術(shù)雖然能檢查hpv分型，但是檢測步驟繁瑣，需要pcr擴(kuò)增后再進(jìn)行核酸雜交及熒光素標(biāo)記，最后在多功能流式點(diǎn)陣儀上讀取微球編碼及其對應(yīng)的熒光強(qiáng)弱信號，檢驗(yàn)結(jié)果回報(bào)時(shí)間偏長；而且pcr擴(kuò)增后開蓋檢測存在污染風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果存在假陽性的風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)依賴于細(xì)胞形態(tài)學(xué)專家或是病理學(xué)家，然而，實(shí)踐中病理醫(yī)生極度短缺，技術(shù)水平和工作經(jīng)驗(yàn)參差不齊，尤其地，在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)和農(nóng)村地區(qū)細(xì)胞學(xué)檢查的推廣工作存在較大的難度。因此基于對宮頸癌早期細(xì)胞學(xué)篩查的需求，迫切需要找到一種不依賴于細(xì)胞病理學(xué)家、具有可接受的敏感性和特異性、可用于大規(guī)模人群篩查的細(xì)胞篩查方法。

3、熒光探針技術(shù)是近些年發(fā)展較快的一種新型檢測技術(shù)，該方法因檢測高靈敏度、高特異性而備受接受，但是該方法因熒光素?cái)?shù)量影響，而無法實(shí)現(xiàn)超多重的檢測，并且應(yīng)用熒光探針技術(shù)開發(fā)的試劑為液相，因此試劑的運(yùn)輸溫度和保存環(huán)境要求在低溫下進(jìn)行，中國發(fā)明專利cn117535405a公開了一種結(jié)合凍干技術(shù)和熔解曲線的技術(shù)方案，該方案將熔解曲線和凍干技術(shù)相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了一種超多重且能夠擺脫保存環(huán)境約束的方法；但是該方案應(yīng)用了不對稱擴(kuò)增技術(shù)，因?yàn)橄拗屏似渲幸粭l引物，導(dǎo)致檢測靈敏度的損失。

4、因此，本發(fā)明提供一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv檢測方法和應(yīng)用，可以用于多種hpv分型的檢測，而且在解決存儲(chǔ)和運(yùn)輸上的問題的同時(shí)，還能夠兼顧高檢測靈敏度的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv檢測方法和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)一種靈敏度高且方便運(yùn)輸和儲(chǔ)存，用于定性檢測hpv-52、16、58、39、18、31、33、59型的一種方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案，一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv基因檢測方法，其特征在于，采用凍干技術(shù)將引物和探針組合物、taq酶、凍干緩沖液進(jìn)行凍干后形成凍干微球；

3、以hpv樣本的核酸為模板dna，將所述凍干微球復(fù)融后，進(jìn)行pcr反應(yīng)，完成所述pcr反應(yīng)后，進(jìn)行熒光采集，并根據(jù)繪制擴(kuò)增曲線和熔解曲線進(jìn)行結(jié)果的判讀。

4、優(yōu)選地，所述hpv基因包括hpv52、hpv16、hpv58、hpv39、hpv18、hpv31、hpv33、hpv59型中的任一種。

5、優(yōu)選地，所述引物和探針組合物通過通過hpv基因序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)得到，包括八組引物和八條探針；

6、優(yōu)選地，所述八組引物，分別包括：

7、第一組引物包括5201f和5202r，序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示；

8、第一條探針包括5203，序列如seq?id?no.17所示；

9、第二組引物包括1601f和1602r，序列分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示；

10、第二條探針包括1603，序列如seq?id?no.18所示；

11、第三組引物包括5801f和5802r，序列分別如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示；

12、第三條探針包括5803，序列如seq?id?no.19所示；

13、第四組引物包括3901f和3902r，序列分別如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示；

14、第四條探針包括3903，序列如seq?id?no.20所示；

15、第五組引物包括1801f和1802r，序列分別如seq?id?no.9和seqidno.10所示；

16、第五條探針包括1803，序列如seq?id?no.21所示；

17、第六組引物包括3101f和3102r，序列分別如seq?id?no.11和seq?id?no.12所示；

18、第六條探針包括3103，序列如seq?id?no.22所示；

19、第七組引物包括3301f和3302r，序列分別如seq?id?no.13和seq?id?no.14所示；

20、第七條探針包括3303，序列如seq?id?no.23所示；

21、第八組引物包括5901f和5902r，序列分別如seq?id?no.15和seq?id?no.16所示；

22、第八條探針包括5903，序列如seq?id?no.24所示。

23、優(yōu)選地，taq酶和所述凍干緩沖液的體積比為1：1。

24、更優(yōu)選地，每1μl所述凍干緩沖液中包括5mm的mgcl2和4mm的海藻糖。

25、優(yōu)選地，所述凍干緩沖液中，包括24mm的(nh4)2so4、濃度為22mm的kcl、濃度為25mm的mgcl2、濃度為2.2mm的dntps、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35％的tween-20、濃度為20mm的海藻糖、質(zhì)量濃度為8wt％的纖維二糖、質(zhì)量濃度為0.005wt％的bsa，tris-hcl調(diào)節(jié)ph至8n8.2，最后用te緩沖液補(bǔ)充至5μl。

26、優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)的程序?yàn)椋?5℃×5min，1cycle；95℃×5s，60℃×25s，45cycles；95℃×10s，1cycle；25-55℃升溫做熔解曲線，升溫速率為0.03℃/s；其中，60℃×25s和25-55℃升溫過程，采用fam、vic、rox熒光通道采集熒光。

27、優(yōu)選地，所述結(jié)果的判讀包括：

28、若fam熒光通道ct≤40時(shí)，判斷為hpv-16型或hpv-18型陽性；

29、若vic熒光通道ct≤40時(shí)，判斷為hpv-31型或hpv-33型或hpv-39型陽性；

30、若rox熒光通道ct≤40時(shí)，判斷為hpv-52型或hpv-58型或hpv-59型陽性；

31、若fam、vic、rox熒光通道ct>40時(shí)，判斷為hpv-52、16、58、39、18、31、33、59型陰性；

32、通過熔解曲線對應(yīng)的各熒光通道內(nèi)tm峰的判讀可以確定具體的hpv亞型，具體地，fam熒光通道中，若tm1＝43±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-18型；

33、若tm2＝51±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-16型；

34、vic熒光通道中，若tm1＝37±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-31型；

35、若tm2＝41±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-33型；

36、若tm3＝48±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-39型；

37、rox熒光通道中，若tm1＝32±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-59型；

38、若tm2＝40±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-58型；

39、若tm3＝48±1℃的峰消失時(shí)，則判定為hpv-52型。

40、作為本發(fā)明另一個(gè)目的，還提供了一種用于hpv基因檢測的凍干微球，至少包括引物和探針組合物、taq酶和凍干緩沖液；其中，每單位凍干微球中的taq酶的含量為8u；所述凍干緩沖液為5μl。

41、作為本發(fā)明的目的之一，還提供了一種用于hpv檢測的試劑盒，至少包括上述的用于hpv基因檢測的凍干微球。

42、該發(fā)明的技術(shù)原理為：若樣本為上述hpv型別陽性，在pcr階段時(shí)，相應(yīng)引物和探針會(huì)被消耗，因此在熔解曲線分析階段不能產(chǎn)生特定的熔解曲線峰；若樣本為上述hpv型別陰性，則pcr階段補(bǔ)損耗各引物探針；若樣本為上述hpv型別陽性，在pcr階段時(shí)，相應(yīng)引物和探針會(huì)被消耗，因此在熔解曲線分析階段不能產(chǎn)生特定的熔解曲線峰；若樣本為上述hpv型別陰性，則pcr階段補(bǔ)損耗各引物探針，本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針在反應(yīng)過程中會(huì)自然卷曲，而在在熔解曲線過程中卷曲狀態(tài)解離，從而產(chǎn)生特定的熔解曲線峰。

43、本發(fā)明提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比取得的有益效果：

44、1.采用本發(fā)明的技術(shù)方案，將引物探針組合物經(jīng)hplc級別純化后，與緩沖液、taq酶配置成可凍干反應(yīng)液，采用凍干工藝凍干后形成熔解曲線凍干微球；該熔解曲線凍干微球不僅容易保存，且使用簡單，只需加入待測核酸樣本后便可在熒光pcr儀上按預(yù)設(shè)的反應(yīng)程序運(yùn)行，避免了環(huán)境氣溶膠污染的問題。

45、2.采用本發(fā)明的技術(shù)方案，在探針的3’端引入若干個(gè)連續(xù)的鳥嘌呤g，通過淬滅熒光作用來降低反應(yīng)體系中的本底熒光，尤其地，能夠使得到的熔解曲線的峰值更窄，熔解曲線峰寬均為5-6℃，顯著地提高了檢測的準(zhǔn)確性。

46、3.采用本發(fā)明的技術(shù)方案能夠顯著地提高檢測的靈敏性，靈敏度提高至1000copies/ml。