本發(fā)明屬于微藻藻種純化，具體涉及一種分離純化微藻（黃絲藻、尖細(xì)柵藻、萊茵衣藻、雨生紅球藻）藻種的方法。

背景技術(shù)：

1、黃絲藻( tribonemaminus)是一種真核絲狀微藻，屬黃藻門，黃藻綱、異絲藻目、黃絲藻科、黃絲藻屬，由不分枝的單個(gè)細(xì)胞組成。黃絲藻的單個(gè)細(xì)胞呈圓柱形，細(xì)胞的直徑和長(zhǎng)度因種而異，一般單個(gè)細(xì)胞直徑約1.5-10?微米左右，長(zhǎng)約為5-30微米(最長(zhǎng)可達(dá)50微米)，其長(zhǎng)約為直徑的1-6倍。相鄰細(xì)胞之間為一“h”形的細(xì)胞壁，黃絲藻的絲狀體即由該“h”細(xì)胞壁兩兩相連而成。黃絲藻具有高產(chǎn)油、抗污染、環(huán)境耐受性強(qiáng)、易采收等優(yōu)良工業(yè)性狀，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水處理、功能脂質(zhì)以及新能源開發(fā)等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2、尖細(xì)柵藻（ scenedesmus?acuminatus）是一種淡水綠藻，屬綠藻門，綠藻綱，綠球藻目，柵藻科，柵藻屬，真性定形群由4-8個(gè)細(xì)胞組成，群體細(xì)胞不排列成一直線，以中部側(cè)壁互相連接；細(xì)胞弓形、紡錘形或新月形，每個(gè)細(xì)胞的上下兩端逐漸尖細(xì)，細(xì)胞壁平滑。4個(gè)細(xì)胞的群體寬7-14微米，細(xì)胞長(zhǎng)19-40微米，寬3-7微米。尖細(xì)柵藻可大量積累儲(chǔ)藏性三酰甘油( triacylglycerol,?tag),細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大面積油體，總脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的50%以上，具有很高的產(chǎn)油潛力，在新能源開發(fā)方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3、萊茵衣藻（ chlamydomonas?reinhardtii）是一種淡水單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門、鞭毛綱、團(tuán)藻目、衣藻屬，是單細(xì)胞單核光合藻類，細(xì)胞呈球形、卵形或橢圓形，直徑為7-10?微米。萊茵衣藻具有生長(zhǎng)迅速，生命周期短等有點(diǎn)，并被廣泛作為探索微藻脂質(zhì)代謝機(jī)制的模式微藻，在保健食品、生物燃料和醫(yī)藥的生產(chǎn)上展現(xiàn)出巨大潛力。

4、雨生紅球藻( haematococcus?pluvialis)是一種淡水單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科。在整個(gè)生命周期中出現(xiàn)四種典型的細(xì)胞形態(tài)：小蟲體、長(zhǎng)有鞭毛的大蟲體、沒有運(yùn)動(dòng)能力的膠鞘體、帶有堅(jiān)硬細(xì)胞壁的紅色大細(xì)胞——紅孢囊( haematocysts)。雨生紅球藻在多種脅迫條件下能夠迅速合成并大量積累蝦青素，其積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于從水產(chǎn)品廢棄物中提取和利用紅發(fā)夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的產(chǎn)量，因此被公認(rèn)是目前自然界中生產(chǎn)天然蝦青素最理想的工具。

5、微藻能夠利用外源添加的碳源（如黃絲藻、尖細(xì)柵藻和萊茵衣藻能夠利用葡萄糖；雨生紅球藻能夠利用乙酸鈉）作為有機(jī)碳源進(jìn)行高密度異養(yǎng)發(fā)酵，可通過異養(yǎng)、兼養(yǎng)或異養(yǎng)-光自養(yǎng)實(shí)現(xiàn)高效培養(yǎng)，具有作為優(yōu)良的微藻能源工程藻株的巨大潛力。

6、對(duì)微藻進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，無論是利用光生物反應(yīng)器進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)還是利用發(fā)酵罐進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，都要求藻種為純種藻株。

7、目前常用的藻種純化方法主要有以下幾種：

8、1.微吸管（毛細(xì)管）分離法：選直徑較細(xì)（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時(shí)，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，吸出放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達(dá)到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達(dá)到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個(gè)培養(yǎng)皿中接20-30個(gè)個(gè)體。從分離出少量細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長(zhǎng)時(shí)期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000-5000單位）或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純?cè)宸N。此法操作技術(shù)要求高，往往吸取一個(gè)細(xì)胞，要反復(fù)幾次才能成功，且適于分離個(gè)體較大藻類。

9、2.水滴分離法：用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個(gè)載片上滴2-4滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個(gè)所需同種藻類個(gè)體，無其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復(fù)重做，直到達(dá)到目的。此法簡(jiǎn)便易行，尤其適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢(shì)種類。分離受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類多用此法。操作時(shí)同樣要求細(xì)致，使用工具及培養(yǎng)液經(jīng)嚴(yán)格消毒。

10、3.稀釋分離法：把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達(dá)到把原混雜生物單個(gè)分離培養(yǎng)的目的。首先把水樣稀釋到每一滴含有一個(gè)左右的生物細(xì)胞（也可能一個(gè)都沒有，也可能有兩個(gè)），在稀釋過程中配合顯微鏡檢查，調(diào)節(jié)稀釋度，然后準(zhǔn)備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進(jìn)行培養(yǎng)。待藻類生長(zhǎng)繁殖達(dá)一定濃度時(shí)，再檢查是否達(dá)到分離目的，若未達(dá)到，再重復(fù)做。此法操作簡(jiǎn)單易行，但有一定程度盲目性。

11、4.平板分離法：此方法的培養(yǎng)基制備和分離方法與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類群落，通過顯微鏡檢查，尋找需要的純?cè)迦郝洌缓笥孟具^的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞，進(jìn)行培養(yǎng)。此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對(duì)于分離已污染雜菌培養(yǎng)液的藻類更合適。

12、以上分離方法經(jīng)過多次操作會(huì)得到純種藻種，但耗時(shí)長(zhǎng)，且操作繁瑣，因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種適用于微藻藻種的快速、有效的獲得純種的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種有效分離純化微藻（黃絲藻、尖細(xì)柵藻、萊茵衣藻、雨生紅球藻）藻種的方法，所述方法通過施用多重聯(lián)合抗生素獲得微藻純種，為相關(guān)性研究提供大量的實(shí)驗(yàn)材料。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種分離純化微藻藻種的方法，包括以下步驟：在濃度分別為100μg/ml鏈霉素、氯霉素、壯觀霉素、氨芐青霉素以及50μg/ml的卡那霉素和1mg/ml的青-鏈雙抗霉素中至少一種，或100μg/ml鏈霉素、氯霉素、壯觀霉素、氨芐青霉素以及50μg/ml的卡那霉素中至少一種與1mg/ml的青-鏈雙抗霉素的組合存在下，使用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)微藻在光照培養(yǎng)箱中對(duì)含有雜菌的微藻藻液進(jìn)行培養(yǎng)處理，單獨(dú)使用上述濃度的抗生素中的一種結(jié)合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，以及進(jìn)行外加碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得純種微藻。

4、其中，所述微藻包括黃絲藻、尖細(xì)柵藻、萊茵衣藻、雨生紅球藻。

5、所述bg11液體培養(yǎng)基，其組分為：nano31.5?g/l、k2hpo4·3h2o?0.04?g/l、mgso4·7h2o?0.075?g/l、cacl2·2h2o?0.036?g/l、citric?acid?0.006?g/l、ammonium?ferriccitrate?0.006?g/l、edta?0.001?g/l、na2co30.02?g/l、h3bo32.86?mg/l、mncl2·h2o?1.81mg/l、znso4·7h2o?0.222?mg/l、cuso4·5h2o?0.079?mg/l、na2moo4·2h2o?0.39?mg/l、co(no3)2·6h2o?0.049?mg/l，定容于1?l蒸餾水，ph=7.1±0.1。

6、具體地，所述分離純化微藻藻種的方法，包括如下步驟：

7、1）配制bg11液體培養(yǎng)基，取含有雜菌的微藻藻液接種到bg11液體培養(yǎng)基中，并單獨(dú)添加作用濃度100?μg/ml的鏈霉素、100μg/ml的氯霉素、100?μg/ml的壯觀霉素、100?μg/ml的氨芐青霉素、50?μg/ml的卡那霉素和1mg/ml的青-鏈雙抗霉素中至少一種抗生素，或添加100μg/ml鏈霉素、100μg/ml氯霉素、100μg/ml壯觀霉素、100μg/ml氨芐青霉素以及50μg/ml的卡那霉素中至少一種與1mg/ml的青-鏈雙抗霉素的組合，在光照培養(yǎng)箱中處理；

8、2）配制bg11固體培養(yǎng)基bg11-a，按比例添加鏈霉素、氯霉素、壯觀霉素、氨芐青霉素、卡那霉素和青-鏈雙抗霉素中至少一種，其中，鏈霉素、氯霉素、壯觀霉素、氨芐青霉素作用濃度為100?μg/ml，卡那霉素50?μg/ml，青-鏈雙抗霉素1?mg/ml；取步驟1）處理過后的微藻藻液接種到添加了抗生素的bg11固體培養(yǎng)基bg11-a中，劃線培養(yǎng)；

9、3）配制含有外加碳源的培養(yǎng)基bg11-c，于細(xì)胞培養(yǎng)板中添加培養(yǎng)基bg11-c，挑取長(zhǎng)出的微藻單菌接種于培養(yǎng)基bg11-c中，培養(yǎng)；

10、4）待微藻明顯長(zhǎng)出，配制bg11-c固體培養(yǎng)基bg11-ca，將bg11-c固體培養(yǎng)基bg11-ca倒入細(xì)菌培養(yǎng)皿中，加入步驟3）所得藻液，平板涂布培養(yǎng)，驗(yàn)證是否純化成功，若純化未成功，重復(fù)步驟2）—4），直至無雜菌長(zhǎng)出，得到微藻純種。

11、上述方法步驟1）中，所述bg11液體培養(yǎng)基，其組分為：nano31.5?g/l、k2hpo4·3h2o0.04?g/l、mgso4·7h2o?0.075?g/l、cacl2·2h2o?0.036?g/l、citric?acid?0.006?g/l、ammonium?ferric?citrate?0.006?g/l、edta?0.001?g/l、na2co30.02?g/l、h3bo32.86?mg/l、mncl2·h2o?1.81?mg/l、znso4·7h2o?0.222?mg/l、cuso4·5h2o?0.079?mg/l、na2moo4·2h2o?0.39?mg/l、co(no3)2·6h2o?0.049?mg/l，定容于1?l蒸餾水，ph=7.1±0.1；

12、按照微藻與液體培養(yǎng)基的體積比1：4的比例接種；

13、所述處理為：置于25?℃光照培養(yǎng)箱中處理24?h，采用2000-3000?lx的光強(qiáng)。

14、上述方法步驟2）中，所述bg11固體培養(yǎng)基bg11-a通過向bg11液體培養(yǎng)基中添加1%瓊脂（指100ml?bg11液體培養(yǎng)基中加入1?g瓊脂）制得；

15、所述劃線培養(yǎng)的條件為：置于25?℃光照培養(yǎng)箱，采用2000-3000?lx的光強(qiáng)。

16、每種微藻由于生長(zhǎng)周期不同，培養(yǎng)時(shí)間也不同，觀察到單藻落長(zhǎng)出即可。

17、上述方法步驟3）中，對(duì)于雨生紅球藻，所述外加碳源培養(yǎng)基為bg11（bg11液體培養(yǎng)基）+0.5g/l的乙酸鈉；

18、對(duì)于黃絲藻、尖細(xì)柵藻、萊茵衣藻，所述外加碳源培養(yǎng)基為bg11+10g/l的葡萄糖。

19、步驟3）中的操作為：向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中添加外加碳源培養(yǎng)基，每孔添加100?μl，挑取長(zhǎng)出的微藻單菌落于96孔板中，置于25?℃光照培養(yǎng)箱，采用2000-3000?lx的光強(qiáng)進(jìn)行培養(yǎng)；

20、每種微藻由于生長(zhǎng)周期不同，培養(yǎng)時(shí)間不同，由于上一步挑取單藻落到孔板的液體后，液體仍未透明，若觀察到出現(xiàn)綠色（淡綠色即可）可進(jìn)行下一步。

21、上述方法步驟4）中，所述bg11-c固體培養(yǎng)基bg11-ca通過向含有外加碳源的培養(yǎng)基bg11-c中加入1%瓊脂制得；

22、藻液與固體培養(yǎng)基bg11-ca的體積比可為100μl：15ml；

23、所述平板涂布培養(yǎng)的條件為：于25?℃光照培養(yǎng)箱中采用2000-3000?lx的光強(qiáng)，培養(yǎng)48-72?h。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種高效、簡(jiǎn)易分離純化微藻藻種的方法，從而獲得無細(xì)菌污染的微藻藻種，起到降低藻種維護(hù)成本和快速獲得批量藻種的目的。同時(shí)，本方法也可用于其他微藻的分離純化，選擇相應(yīng)藻類的培養(yǎng)基替代本方法中培養(yǎng)基即可。