(一)本發(fā)明屬于生物化工，特別涉及一株大腸桿菌bgl及其在生物轉(zhuǎn)化法制備黃芩素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、(二)背景技術(shù)

1、黃芩素(baicalein)，化學(xué)名5,6,7-三羥基黃酮，cas?491-67-8，分子式c15h10o5，分子量為270.24，因其較多地存在于植物黃芩(scutellaria?baicalensis)中而得名。黃芩素還存在于半枝蓮(cutellaria?barbata)、木蝴蝶(oroxylumindicum)、大車前(plantagomajor)等植物中，研究表明，黃芩素具有較強的抗腫瘤活性、抗氧化、抗炎、清除自由基、抗過敏等藥理作用，對免疫系統(tǒng)、血管、神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，作為藥物或保健食品應(yīng)用前景廣闊。

2、黃芩素可以從上述這些植物中分離獲得，但其含量都相對較低，即便是黃芩素含量相對較高的黃芩中，含量一般低于1％，所以直接從黃芩中提取黃芩素的得率一般比較低，相比之下，黃芩中的黃芩苷(baicalin，cas21967-41-9)，即黃芩素-7-o-葡萄糖醛酸含量可以高達(dá)9.0％，所以，在從黃芩中提取黃芩素時，常用輔以酸水解或酶解法將黃芩苷轉(zhuǎn)化黃芩素后再提取，黃芩素的提取得率可以顯著提高，如王宏志等用酶解法從黃芩中提取黃芩素，比傳統(tǒng)的水煎法得到提取物中黃芩素的含量提高了近5倍[王宏志,喻春皓,高鈞,等.酶法提取黃芩中黃芩素、漢黃芩素.中藥材,2007,30(7):851-854]；張新國等利用纖維素酶和異淀粉酶復(fù)合酶法提取中草藥黃芩中的黃芩素，比不加酶提取黃芩素提取率提高約3倍[張新國,陸穎,李曉茹,等.復(fù)合酶法提取黃芩素的工藝研究.中國中醫(yī)藥科技,2016,23(3):291-293]。

3、從黃芩中提取黃芩素的得率低，即使輔以酶解法提取，仍存在提取得率不理想、能耗高等問題。如上所述，制備黃芩素的前體物質(zhì)黃芩苷廣泛存在于許多植物中，可以從這些植物中大量提取，生產(chǎn)成本較低，如果直接以黃芩苷為原料，水解切除葡萄糖醛酸而轉(zhuǎn)化為黃芩素，則具有更高的生產(chǎn)效率。黃芩苷的糖苷切除可以采用化學(xué)水解或生物轉(zhuǎn)化法，采用化學(xué)水解法，往往存在苷元結(jié)構(gòu)容易被破壞，產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，產(chǎn)物收率低，且易造成環(huán)境污染等問題；相比之下，生物轉(zhuǎn)化法具有不破壞苷元結(jié)構(gòu)、條件溫和、副產(chǎn)物少、轉(zhuǎn)化率高且綠色環(huán)保高效的優(yōu)點。目前，已有生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素的研究報道，如賀美等采用米曲霉發(fā)酵法轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素，在底物濃度為0.2g/l時，轉(zhuǎn)化率為40.72％[賀美,邱德全,柏仕杰.米曲霉兩步活化法對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的與鑒定.廣東海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)),2007,27(6):41-44]；周琪等用基因重組菌表達(dá)的β-葡萄糖醛酸苷酶轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素，在黃芩苷濃度為200μmol/l時，轉(zhuǎn)化率可達(dá)72.5％[周琪,竇同意,丁樂樂,等.β-葡萄糖醛酸苷酶的重組表達(dá)及對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2017,39(2):110-115]。采用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化，不足之處在于發(fā)酵周期長，如賀美等的研究中，轉(zhuǎn)化時間需要3d；而采用酶法轉(zhuǎn)化，酶的成本較高，且底物濃度較低，如周琪的研究中，底物濃度僅為200μmol/l(0.0893g/l)，較低的底物濃度很難獲得較高的生產(chǎn)效率，這些方法工業(yè)化應(yīng)用受到限制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、(三)
技術(shù)實現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的微生物新菌株—大腸桿菌(escherichia?coli)bgl及其在轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素中的應(yīng)用，首先篩選獲得了一株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶活性高的菌株，再經(jīng)過紫外線、微波和等離子誘變，經(jīng)過篩選獲得產(chǎn)酶活性進(jìn)一步提高的菌株，經(jīng)培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，以含菌體的發(fā)酵液作為粗酶液，直接將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素(反應(yīng)式見圖1)，本方法具有步驟簡單、專一性好和轉(zhuǎn)化得率高的優(yōu)點，克服了現(xiàn)有生物轉(zhuǎn)化法制備黃芩素方法存在周期長、轉(zhuǎn)化效率低的問題。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的微生物新菌株—大腸桿菌(escherichiacoli)bgl，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號：gdmcc?no:64699，保藏日期2024年5月29日，地址：廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓；郵編：510075。

4、本發(fā)明所述大腸桿菌bgl，是從新鮮牛糞中分離，經(jīng)過誘變和篩選得到的優(yōu)良菌株。所述大腸桿菌bgl的形態(tài)特征如下：接種于lb平板培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24h，形成直徑0.3–0.5cm的菌落，菌落圓形，邊緣整齊，乳白色。菌體呈短桿狀，大小約0.5–0.8μm×1.0–2.0μm，革蘭氏染色陰性，不形成芽孢。在麥康凱培養(yǎng)基上菌落呈桃紅色，形態(tài)與在lb平板培養(yǎng)基上相似，周圍有膽鹽沉淀環(huán)。所述大腸桿菌bgl的16s?rdna的部分核苷酸序列如seq?idno.1所示。

5、本發(fā)明還提供一種所述大腸桿菌bgl在生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是將大腸桿菌bgl經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的發(fā)酵液為粗酶液，以黃芩苷為底物，以甲醇為助溶劑構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在35–40℃、100–150r/min恒溫振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離獲得黃芩素。

6、進(jìn)一步，所述的粗酶液中大腸桿菌的干菌體濃度為2.5–4.0g/l，β-葡萄糖醛酸苷酶的活力為96.7–117u/l。

7、進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化體系中，黃芩苷的加入終濃度為0.1–0.2g/l；甲醇加入體積分?jǐn)?shù)為20％–25％，優(yōu)選的，用甲醇溶解黃芩苷，然后再與粗酶液混合。

8、進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間為2–4h。

9、進(jìn)一步，所述粗酶液按如下方法制備：將大腸桿菌bgl接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于35–37℃、200–250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)12–16h，獲得的發(fā)酵液即為粗酶液；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為：乳糖40–50g/l，蛋白胨10–12g/l，酵母浸粉5–6g/l，nacl?5–10g/l，溶劑為自來水，ph?7.0–7.2。

10、所述的大腸桿菌bgl在接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基前，通常需要先經(jīng)過lb液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)制備種子液，然后種子液按體積濃度4％–8％的量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，所述種子液按如下方法制備：

11、(1)活化培養(yǎng)：將大腸桿菌bgl接種于新鮮lb斜面培養(yǎng)基，于35–37℃培養(yǎng)24–36h，獲得大腸桿菌bgl活化菌體。所述的lb斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，nacl?10g/l，瓊脂20g/l，溶劑為自來水，ph?7.0；

12、(2)種子培養(yǎng)：將大腸桿菌bgl活化菌體接種于lb液體培養(yǎng)基，于35–37℃、150–200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12–16h，獲得大腸桿菌bgl種子液。所述的lb液體培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，nacl?10g/l，溶劑為自來水，ph?7.0。

13、本發(fā)明所述的黃芩素分離的方法為：轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液用等體積的乙酸乙酯萃取2–3次，合并萃取液于圓底燒瓶中，于45℃、–0.1mpa減壓蒸干乙酸乙酯后，加入所得產(chǎn)物質(zhì)量10–20倍的丙酮溶解殘留物，經(jīng)過濾后，再次減壓蒸干丙酮，于85℃干燥至恒重，即得黃芩素粗品。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明用產(chǎn)高活性β-葡萄糖醛酸苷酶的大腸桿菌bgl為發(fā)酵菌種，以含菌體的發(fā)酵液作為粗酶液，以黃芩苷為底物，以甲醇為助溶劑，生物轉(zhuǎn)化法制備黃芩素。在底物濃度為0.2g/l時，黃芩素的轉(zhuǎn)化得率為81.2％。相比于化學(xué)水解法，本發(fā)明具有專一性好，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少的優(yōu)點；相比于純酶法，粗酶液的制備成本低，底物濃度高，轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點。