本發(fā)明涉及硫酸軟骨素鈉，具體涉及一種高純度低分子量硫酸軟骨素鈉的制備工藝。

背景技術(shù)：

1、硫酸軟骨素鈉主要由n-乙酰半乳糖胺（2-乙酰胺-2脫氧-β-d-吡喃半乳糖）和d-葡萄糖醛酸的共聚物的硫酸酯鈉鹽，共聚物內(nèi)己糖通過β-1，3及β-1，4糖苷鍵交替連接。硫酸軟骨素鈉多來自豬軟骨、豬喉骨、雞胸軟骨，?；蜓虮枪恰⒑砉?、軟肋、氣管、月牙骨及各部位的雜軟骨，以及魚軟骨等，經(jīng)軟骨降解、核心蛋白水解、去蛋白、回收、純化等過程制得。

2、其中低分子硫酸軟骨素鈉是硫酸軟骨素鈉的一種形式，其分子量相對較低。低分子硫酸軟骨素鈉是通過特定的降解方法（如氧化降解法、酸降解法、微波輔助降解法以及酶降解法等）從硫酸軟骨素鈉中制備得到的，其分子量較小，與普通的硫酸軟骨素鈉相比，低分子硫酸軟骨素鈉的分子量更低，這使其在某些應(yīng)用中具有更好的滲透性和生物利用度。由于分子量的降低，低分子硫酸軟骨素鈉可能表現(xiàn)出更高的生物活性，如更強的抗炎、抗凝血和促進(jìn)軟骨修復(fù)等效果。

3、因此，開發(fā)制備低分子硫酸軟骨素鈉是一種研發(fā)趨勢。雖然目前已經(jīng)有一些制備低分子量硫酸軟骨素鈉的方法，但是一些方法中，會使用到多種氯化鈉以外的化學(xué)制劑，例如申請?zhí)枮?02010815590.9的國內(nèi)專利公開了一種低分子硫酸軟骨素鈉的制備方法，以豬來源的硫酸軟骨素鈉為原料，經(jīng)過季銨鹽鹽化、芐基酯化、降解、氧化脫色、分級控制、凍干等工藝，制備出低分子硫酸軟骨素鈉；但是該方法中，采用了芐索氯銨、氯化芐等化學(xué)試劑，會在硫酸軟骨素鈉中引入新的雜質(zhì)，從而影響硫酸軟骨素鈉的使用性能。另外，目前制備低分子硫酸軟骨素鈉難以同時兼顧產(chǎn)品的純度以及收率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高純度低分子量硫酸軟骨素鈉的制備工藝，在制備硫酸軟骨素鈉的過程中不會引入非常規(guī)雜質(zhì)，可制備得到高純度的低分子量硫酸軟骨素鈉，且整體收率高。

2、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

3、一種高純度低分子量硫酸軟骨素鈉的制備工藝，包括以下步驟：

4、（1）將預(yù)處理后的軟骨原料進(jìn)行干燥，然后進(jìn)行粗粉碎，過篩，得粗粉碎料；然后將所得粗粉碎料進(jìn)行液氮浸漬處理；將經(jīng)液氮處理后的粗粉碎料進(jìn)行氣流粉碎，得軟骨細(xì)粉碎料；

5、（2）將軟骨細(xì)粉碎料置于水中浸泡，再煮沸；然后冷卻至室溫，加入氯化鈉，并加入氫氧化鈉溶液調(diào)整ph值為10-11，然后將所得混合料液進(jìn)行多次微波輻射處理，每次微波輻射處理的同時進(jìn)行超聲波處理；然后冷卻至室溫，得到混合處理料液；

6、（3）將所述混合處理料液依次進(jìn)行堿性蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解；然后進(jìn)行酶滅活處理，經(jīng)過濾得到濾液一；

7、（4）將所述濾液一先進(jìn)行微濾；再采用大孔樹脂層析柱吸附，并采用氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；

8、（5）將所述洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，所得濃縮液中加入乙醇，靜置，經(jīng)過濾得沉淀物一；

9、（6）將所述沉淀物一中加入氯化鈉溶液，混合，將所得混合液進(jìn)行硫酸軟骨素裂解酶酶解，然后進(jìn)行酶滅活處理，經(jīng)過濾得到濾液二；將所述濾液二進(jìn)行多次微波輻射處理，每次微波輻射處理的同時進(jìn)行超聲波處理，得到處理液；

10、（7）將所述處理液采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，得到超濾液；

11、（8）將所述超濾液用鹽酸調(diào)整ph，加入乙醇，攪拌后靜置，然后過濾，得沉淀物二；

12、（9）將所述沉淀物二采用乙醇脫水，過濾并進(jìn)行干燥，得到所述硫酸軟骨素鈉。

13、優(yōu)選的，步驟（1）中，所述預(yù)處理后的軟骨原料通過以下方法獲得：將軟骨原料洗凈后，加熱煮沸，并去除浮油，取出洗凈，得到預(yù)處理后的軟骨原料；

14、所述過篩的目數(shù)為60-100目；

15、所述液氮浸漬處理時，浸漬時間為20-40min。

16、優(yōu)選的，步驟（2）中，所述水的加入量為軟骨細(xì)粉碎料質(zhì)量的5-6倍；

17、所述浸泡的時間為3-5h，煮沸的時間為30-60min；所述氯化鈉的加入量為軟骨細(xì)粉碎料質(zhì)量的2.5-4%。

18、優(yōu)選的，步驟（2）中，所述微波輻射處理的功率為1000-1500w，每次微波輻射處理的時間3-5min，相鄰兩次微波輻射處理之間的間歇時間為1-2min；所述微波輻射處理的次數(shù)為10-15次；每次微波輻射處理時同時進(jìn)行超聲波處理，超聲波處理的功率為500-1000w。

19、優(yōu)選的，步驟（3）具體包括以下步驟：將所述混合處理料液的溫度保持在35-38℃之間，調(diào)節(jié)ph值為8.5-9.5，再加入軟骨細(xì)粉碎料質(zhì)量0.3-0.4%的堿性蛋白酶，并恒溫酶解2-3h；保持溫度在35-38℃之間，加入軟骨細(xì)粉碎料質(zhì)量0.3-0.4%的木瓜蛋白酶，并恒溫酶解2-3h；酶解結(jié)束后升溫至95-100℃進(jìn)行酶滅活，保持5-10min，然后冷卻至室溫，過濾，得濾液。

20、優(yōu)選的，步驟（4）中，所述微濾時采用0.2μm微濾組件進(jìn)行微濾；

21、所述大孔樹脂層析柱中的大孔樹脂為大孔樹脂d315；所述大孔樹脂的使用量為軟骨細(xì)粉碎料質(zhì)量的2.5-3.5倍；所述氯化鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-15%，所述氯化鈉溶液與大孔樹脂的質(zhì)量比為3-4：1，洗脫時間為2.5-3.5h。

22、優(yōu)選的，步驟（5）具體包括以下步驟：將所述洗脫液在60-70℃下進(jìn)行減壓濃縮，使所得濃縮液為洗脫液體積的30-35%，然后加入濃縮液體積8-10倍的體積分?jǐn)?shù)在95%以上的乙醇，靜置3-5h，然后進(jìn)行過濾，得沉淀物一。

23、優(yōu)選的，步驟（6）中，所述沉淀物一中加入其質(zhì)量10-12倍的氯化鈉溶液；所述氯化鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5-3%；

24、將所得混合液進(jìn)行硫酸軟骨素裂解酶酶解包括以下步驟：將所得混合液采用鹽酸將調(diào)節(jié)ph值為6.5-7.0，并保持溫度在35-38℃之間，加入軟骨細(xì)粉碎料質(zhì)量0.05-0.1%的硫酸軟骨素裂解酶，并恒溫酶解2-3h；

25、步驟（6）中，所述微波輻射處理的功率為1000-1500w；每次微波輻射處理的時間3-5min，相鄰兩次微波輻射處理之間的間歇時間為1-2min；所述微波輻射處理的次數(shù)為8-12次；每次微波輻射處理時同時進(jìn)行超聲波處理，超聲波處理的功率為500-1000w；

26、優(yōu)選的，步驟（7）中，所述超濾膜的截留分子量為1000-5000da。

27、優(yōu)選的，步驟（8）中，將所述超濾液用鹽酸調(diào)整ph值為5.8-6.0；加入乙醇后使所得溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為85-90%，所述攪拌時間為1-1.5h，所述靜置時間為7-10h；

28、步驟（9）具體包括以下步驟：將所述沉淀物二先采用體積分?jǐn)?shù)為92-95%的乙醇浸泡2次，每次2-3h，過濾后再采用無水乙醇洗滌，然后置于50-55℃下進(jìn)行真空干燥，得到硫酸軟骨素鈉。

29、本發(fā)明的有益效果是：

30、1、本發(fā)明在制備硫酸軟骨素鈉時，在堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解之前，通過同時對加堿后的軟骨細(xì)粉碎料混合料液進(jìn)行間歇式微波輻射和超聲波處理，其使大分子物質(zhì)的機械性斷鏈增強，使降解效果加強，從而獲得更多的低分子量硫酸軟骨素鈉。而在后續(xù)在硫酸軟骨素裂解酶酶解后，再次進(jìn)行間歇式微波輻射和超聲波處理，微波輻射、超聲波處理再次協(xié)同作用，可進(jìn)一步促使硫酸軟骨素鈉的降解，增加低分子量硫酸軟骨素鈉的收率。且通過研究，本發(fā)明采用的間歇式微波輻射和超聲波處理工藝，相比于連續(xù)式微波輻射和超聲波處理工藝，可使所獲得的低分子量硫酸軟骨素鈉純度明顯提升。

31、2、本發(fā)明將經(jīng)過粗粉碎的軟骨原料采用液氮浸漬處理，可使粉碎料的孔隙率增強，且其脆性變大，之后再進(jìn)行氣流粉碎，可獲得多孔隙且粒徑細(xì)小的軟骨細(xì)粉碎料，可提高降解效率，并進(jìn)而提升硫酸軟骨素鈉的收率。

32、3、本發(fā)明在制備硫酸軟骨素鈉的過程中，在經(jīng)過酶解后，并依次進(jìn)行微濾、大孔樹脂吸附、第一次醇沉處理，之后再進(jìn)行二次酶解、超濾、二次醇沉處理等工藝，通過上述各工藝配合，可獲得純度較高的低分子量硫酸軟骨素鈉。