本發(fā)明涉及新型人透明質(zhì)酸酶變體，與作為水解透明質(zhì)酸的酶的人透明質(zhì)酸酶相比，所述新型人透明質(zhì)酸酶變體具有增加的酶活性和熱穩(wěn)定性；并且更特別地涉及透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段，所述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段在對(duì)應(yīng)于具有seq?id?no:1的氨基酸序列的野生型ph20、優(yōu)選由氨基酸殘基l36至s490組成的成熟野生型ph20中的α螺旋區(qū)域和/或其接頭區(qū)域的區(qū)域中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基取代，并且在所述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段中，選擇性地缺失n末端或c末端氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)；產(chǎn)生所述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段的方法；以及包含所述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段的藥物組合物。

背景技術(shù)：

1、人皮膚由表皮、真皮和皮下脂肪層構(gòu)成，并且皮膚中存在六種類型的糖胺聚糖。這些糖胺聚糖包括透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角蛋白。

2、這些糖胺聚糖由重復(fù)的二糖糖單元構(gòu)成。在糖胺聚糖中，二糖糖單元的數(shù)目不同，而范圍從幾百到幾千。在糖胺聚糖中，透明質(zhì)酸在皮膚中的存在超過(guò)在人體中的量的一半。透明質(zhì)酸是由存在于細(xì)胞膜中的透明質(zhì)酸合酶合成的，其單獨(dú)存在而不與蛋白聚糖結(jié)合，并且是唯一不具有硫酸基團(tuán)的糖胺聚糖。其他糖胺聚糖與蛋白聚糖結(jié)合并且具有硫酸基團(tuán)。透明質(zhì)酸由通過(guò)交替的β-1,4和β-1,3鍵連接的葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺組成，并且由這些二糖的約5,000個(gè)重復(fù)單元構(gòu)成。已知每天人體中約三分之一(5g)的透明質(zhì)酸被轉(zhuǎn)換(turn?over)。

3、透明質(zhì)酸酶是降解存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸的酶。已知人體中存在六種類型的透明質(zhì)酸酶：它們是hyal1、hyal2、hyal3、hyal4、hyalps1和ph20/spam1。人hyal1和hyal2在大多數(shù)組織中表達(dá)。ph20/spam1(以下稱為ph20)在精子質(zhì)膜和頂體膜中表達(dá)。然而，hyalps1不表達(dá)，因?yàn)槠涫羌倩?。根?jù)切割透明質(zhì)酸的方法，透明質(zhì)酸酶分為三種類型：通過(guò)使用h2o切割n-乙酰葡糖胺與葡萄糖醛酸之間的β-1,4鍵的酶(ec?3.2.1.35)；通過(guò)使用h2o切割n-乙酰葡糖胺與葡萄糖醛酸之間的β-1,3鍵的酶(ec?3.2.1.36)；以及在不使用h2o的情況下切割β-1,4鍵的細(xì)菌透明質(zhì)酸酶(ec?4.2.99.1)。

4、hyal1的催化氨基酸是d129和e131，它們通過(guò)底物輔助催化來(lái)水解透明質(zhì)酸。hyal1在3至4的酸性ph下展現(xiàn)出最佳活性，而在4.5或更高的ph下沒有酶活性。與hyal1形成對(duì)照，ph20在3至8的寬ph范圍內(nèi)展現(xiàn)出酶活性。

5、arming等人鑒定ph20的催化氨基酸為d111和e113(arming等人,1997)。arming等人將leu標(biāo)記為成熟蛋白的第一個(gè)氨基酸，并且因此帶有信號(hào)肽的全長(zhǎng)ph20的催化氨基酸分別對(duì)應(yīng)于d146和e148。

6、透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸，從而降低透明質(zhì)酸在細(xì)胞外基質(zhì)中的粘度并增加其向組織(皮膚)的滲透性。皮膚的皮下區(qū)域具有約7.0至7.5的中性ph。因此，在各種類型的透明質(zhì)酸酶中，ph20在臨床實(shí)踐中被廣泛使用(bookbinder等人,2006)。在其中ph20用于臨床實(shí)踐的例子中，ph20在眼科手術(shù)中用作眼松弛劑和麻醉添加劑，并且還與皮下注射的抗體治療劑共同給予(bookbinder等人,2006)。此外，基于透明質(zhì)酸在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的特性，ph20用于水解腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸，從而增加抗癌治療劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的接近。此外，其還用于促進(jìn)組織中過(guò)量存在的體液和血液的再吸收。

7、ph20由lathrop等人首先在豚鼠精子中鑒定，并且還已知在不同物種的精子中表達(dá)。人ph20基因由lin等人和gmachl等人克隆。人ph20具有seq?id?no:1的氨基酸序列，其由509個(gè)氨基酸殘基組成，并且與豚鼠ph20基因展現(xiàn)出60％的氨基酸同一性。人ph20酶由spam1(精子粘附分子-1)基因編碼，并且ph20的ser490以與精子質(zhì)膜表面上和頂體膜中的糖基磷脂酰肌醇(gpi)結(jié)合的形式存在。當(dāng)精子穿過(guò)卵母細(xì)胞富含透明質(zhì)酸的卵丘層滲透卵母細(xì)胞時(shí)，其使用ph20水解透明質(zhì)酸。精子中ph20以相當(dāng)于蛋白質(zhì)量的1％或更少的量存在，并且具有六個(gè)n-糖基化位點(diǎn)(n82、n166、n235、n254、n368和n393)。

8、目前可商購(gòu)的ph20是通過(guò)從?；蚓d羊的睪丸中提取獲得的。其例子包括(牛透明質(zhì)酸酶)和(綿羊透明質(zhì)酸酶)。

9、牛睪丸透明質(zhì)酸酶(bth)是通過(guò)在翻譯后修飾過(guò)程中從牛野生型ph20移除信號(hào)肽和c末端上的56個(gè)氨基酸而獲得的。bth也是一種糖蛋白，并且基于包括氨基酸的總組分，其甘露糖含量為5％且葡萄糖胺含量為2.2％。當(dāng)將動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶以高劑量重復(fù)給予至人體時(shí)，可以產(chǎn)生中和抗體。由于動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶除ph20之外還含有其他生物材料，因此其在給予至人體時(shí)可能引起過(guò)敏反應(yīng)(bookbinder等人,2006)。特別地，由于擔(dān)心瘋牛病，從牛提取的ph20的生產(chǎn)和使用可能受到限制。為了克服此問(wèn)題，已對(duì)人ph20的重組蛋白進(jìn)行了研究。

10、據(jù)報(bào)道，人ph20的重組蛋白在酵母(畢赤酵母(p.pastoris))、ds-2昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在昆蟲細(xì)胞和酵母中產(chǎn)生的重組ph20蛋白在翻譯后修飾過(guò)程中的n-糖基化模式方面與人ph20不同。

11、在透明質(zhì)酸酶中，僅確定了hyal1(pdb?id:2pe4)(chao等人,2007)和蜂毒透明質(zhì)酸酶(pdb?id:1fcq、1fcu、1fcv)的三維結(jié)構(gòu)。hyal1由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)egf樣結(jié)構(gòu)域。催化結(jié)構(gòu)域呈(β/α)8形式，其中表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α螺旋和β鏈各自重復(fù)八次(chao等人,2007)。egf樣結(jié)構(gòu)域在變體中是完全保守的，在所述變體中hyal1的c末端被不同地拼接。hyal1和ph20的氨基酸序列是35.1％相同的，并且尚未發(fā)現(xiàn)ph20的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

12、一種人ph20的重組蛋白是由halozyme?therapeutic,inc.開發(fā)的，并以商品名出售(bookbinder等人,2006；frost,2007)。

13、當(dāng)ph20的催化氨基酸d146和e148分別突變?yōu)樘於０?d146n)和谷氨酰胺(e148q)時(shí)，不存在酶活性(arming等人,1997)。此外，當(dāng)ph20的r246被甘氨酸取代時(shí)，酶活性降低了90％，并且當(dāng)e319被谷氨酰胺取代并且r322被蘇氨酸取代時(shí)，酶活性消失。與野生型ph20相比，其中在ph20的c末端處移除了36個(gè)氨基酸(474-509氨基酸截短)的變體顯示酶活性降低了75％。此變體不分泌到細(xì)胞外，而是保留在hela細(xì)胞中。當(dāng)從ph20移除c末端134個(gè)氨基酸時(shí)，ph20沒有酶活性，也不分泌到細(xì)胞外。根據(jù)frost等人，ph20的c末端477-483區(qū)域?qū)τ诳扇苄员磉_(dá)是必不可少的(frost,2007)。全長(zhǎng)ph20(1至509)或在位置467處c末端被截短的ph20變體的活性僅為在位置477至483中的一處c末端被截短的ph20變體的10％(frost,2007)。

14、同時(shí)，重組ph20在重組細(xì)胞中仍沒有足夠的熱穩(wěn)定性或表達(dá)水平。因此，工業(yè)上對(duì)具有進(jìn)一步改善的生物學(xué)和物理化學(xué)特征的重組透明質(zhì)酸酶有很大的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問(wèn)題

2、本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段，與野生型ph20、優(yōu)選成熟野生型ph20相比，所述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段的熱穩(wěn)定性、酶活性和表達(dá)水平得到改善。

3、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療癌癥的組合物，所述組合物包含上述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段；以及使用所述組合物治療癌癥的方法。

4、技術(shù)方案

5、為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段，所述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段在對(duì)應(yīng)于野生型ph20、優(yōu)選成熟野生型ph20的氨基酸序列中的α螺旋區(qū)域和/或其接頭區(qū)域的區(qū)域中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基取代，并且在所述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段中，選擇性地缺失n末端或c末端氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)。

6、本發(fā)明還提供了用于治療癌癥的組合物，所述組合物包含上述透明質(zhì)酸酶ph20變體或其片段；以及使用所述組合物治療癌癥的方法。