本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程，特別是一種具有提高植物抗真菌侵染能力的岷江百合轉(zhuǎn)錄因子基因 lrbhlh1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物在生長發(fā)育過程中，容易遭受來自于生物或非生物的脅迫，最終影響植物產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。由病原真菌引起的病害嚴(yán)重影響著植物的生長發(fā)育，真菌病害約占病害總數(shù)的70%~80%（杜艷楠,?王萌,?馬建強(qiáng),?等.?植物病原真菌早期檢測技術(shù)及其在橡膠樹炭疽病預(yù)測預(yù)報中的應(yīng)用.?熱帶生物學(xué)報,?2021,?12(1):?124-131.）。目前對植物病害的防治方法以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，但對于栽培周期長的植物防治效果較差，而且還存在一些弊端。農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品上的殘留嚴(yán)重影響了其品質(zhì)。另外，在土壤中的殘留則影響著土壤的健康狀況，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行分子育種，加強(qiáng)植物自身防御病原真菌侵染的能力，能克服化學(xué)防治帶來的弊端，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

2、為了應(yīng)答各種發(fā)育信號和環(huán)境變化，植物通過復(fù)雜的信號通路來建立有效的防御反應(yīng)，它們產(chǎn)生脅迫誘導(dǎo)的植物化學(xué)物質(zhì)，在植物免疫中發(fā)揮不可或缺的作用。轉(zhuǎn)錄因子(transcription?factor)通過感知脅迫信號和調(diào)控下游防御基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是一種能夠與靶基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。典型的植物轉(zhuǎn)錄因子一般由4個功能區(qū)組成，即dna結(jié)合區(qū)（dna-binding?domain）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（transcription?regulation?domain）、細(xì)胞核定位信號區(qū)（nulcear?localization?signal）和寡聚化位點(diǎn)（oligomerization?site）（陳霞,?羅世巧,段翠芳,?等.?高等植物轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展.?安徽農(nóng)學(xué)通報,?2008,?14(9):?48-52,?65.）。通過基因工程手段使一個抗病轉(zhuǎn)錄因子基因在植物中超表達(dá)就相當(dāng)于轉(zhuǎn)入了多個抗病基因，從而提高綜合抗病能力。因此，轉(zhuǎn)錄因子已成為近年來植物抗病基因工程的研究熱點(diǎn)。在植物中有大約58個轉(zhuǎn)錄因子家族，其中，有六個主要的轉(zhuǎn)錄因子家族ap2/erf(apetala2/ethylene?responsive?factor)、bhlh?(basic?helix-loop-helix)、myeloblastosis?related?(myb)、nac?[nam?(no?apical?meristem)，ataf1/2(arabidopsis?transcription?activation?factor)、cuc2?(cup-shaped?cotyledon)]、wrky和?bzip?(basic?leucine?zipper)參與生物和非生物脅迫反應(yīng)（ng?dw,?abeysinghejk,?kamali?m.?regulating?the?regulators:?the?control?of?transcription?factorsin?plant?defense?signaling.?international?journal?of?molecular?sciences.2018,?19(12):?3737）。

3、bhlh家族已經(jīng)被證明是植物防御反應(yīng)中的調(diào)節(jié)因子。bhlh蛋白包含60個氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，其中末端的堿性殘基與dna位點(diǎn)結(jié)合，兩個 α螺旋介導(dǎo)其與蛋白質(zhì)的相互作用，以構(gòu)建同源或異源二聚體復(fù)合物(atchley?wr,?fitch?wm.?a?natural?classificationof?the?basic?helix-loop-helix?class?of?transcription?factors.?proceedings?ofthe?national?academy?of?sciences?of?the?united?states?of?america.?1997,?94(10):?5172-5176.)。bhlh轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)節(jié)次生代謝物的生物合成，如類黃酮、花色素苷、硫代葡萄糖苷、二萜植物抗毒素和皂苷，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)（meraj?ta,?fu?j,raza?ma,?et?al.?transcriptional?factors?regulate?plant?stress?responsesthrough?mediating?secondary?metabolism.?genes?(basel).?2020,?11(4):?346）。菊花 cmbhlh18的異源過表達(dá)通過增強(qiáng)胼胝質(zhì)沉積、阻止孢子進(jìn)入葉片、減少ros積累、提高抗氧化酶和防御酶的活性以及促進(jìn)抗性相關(guān)基因表達(dá)來提高擬南芥對壞死營養(yǎng)型真菌的抗性（ding?y,?wang?x,?wang?d,?et?al.?identification?of?cmbhlh?transcription?factorfamily?and?excavation?of cmbhlhsresistant?to?necrotrophic?fungus alternariain c hrysanthemum.?genes?(basel).?2023,?14(2):?275.）。轉(zhuǎn)錄因子ghpas1屬于bhlh家族， ghpas1的沉默增加了棉花對黃萎病易感性，相反，其過表達(dá)提高了棉花對大麗輪枝菌的抗性（zhang?j,?gu?m,?wu?h,?et?al.?ghpas1,?a?bhlh?transcription?factor?in?uplandcotton?( gossypium?hirsutum),?positively?regulates verticillium? dahliaresistance.?industrial?crops&products,?2023,?192:?116077）。

4、百合是百合科（liliaceae）百合屬（ lilium）多年生草本植物。百合具有較高的觀賞價值和市場需求，目前已成為全球鮮切花市場的主要花卉之一。但隨著百合種植面積不斷擴(kuò)大，從種球繁育到鮮切花生產(chǎn)過程中均受到多種病害的威脅，包括枯萎病、灰霉病、病毒病等（朱茂山，關(guān)天舒.?百合主要病害及其防治關(guān)鍵技術(shù).?遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),?2007(6):41-43.）。其中，由鐮刀屬（ fusarium?spp.）真菌引起的枯萎病是百合生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害（黃娟,?付亮,?王強(qiáng)等.?百合枯萎病的發(fā)生原因及防治措施.?南方農(nóng)業(yè),?2015,?9(15):?23-24.）。鐮刀菌侵染百合種球后引起基盤壞死、鱗片腐爛脫落，造成種球質(zhì)量下降；植株感染鐮刀菌后葉片變黃、萎蔫下垂，植株提早枯萎死亡，嚴(yán)重影響百合切花的產(chǎn)量和品質(zhì)。其中尖孢鐮刀菌（ fusarium?oxysporum）致病性最強(qiáng)、分離頻率最高，是百合枯萎病的主要致病菌。岷江百合（ lilium?regale?wilson）為我國特有的野生百合，主要分布于四川省岷江流域海拔800～2700m的河谷到山腰的巖石縫中，具有強(qiáng)的枯萎病抗性，是現(xiàn)代百合育種的重要種質(zhì)資源。bhlh家族的轉(zhuǎn)錄因子在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，因此對岷江百合中 lrbhlh1的發(fā)掘以及功能分析具有重要的研究及其應(yīng)用價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種岷江百合轉(zhuǎn)錄因子基因 lrbhlh1及其提高煙草對草莖點(diǎn)霉（ phoma?herbarum）、茄鏈格孢（ alternaria?solani）抗性中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明從岷江百合中克隆獲得轉(zhuǎn)錄因子基因 lrbhlh1， lrbhlh1核苷酸序列如seqid?no:1所示，該基因cdna全長序列為972bp，包含一個735bp的開放閱讀框、46bp的5’非翻譯區(qū)、191bp的3’非翻譯區(qū)，編碼如seq?id?no:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

3、本發(fā)明中 lrbhlh1基因的編碼區(qū)是seq?id?no:1中第47-781位所示的核苷酸序列。

4、本發(fā)明分離克隆岷江百合的一個轉(zhuǎn)錄因子基因 lrbhlh1的完整cdna片段，利用根癌農(nóng)桿菌（ agrobacterium?tumefaciens）介導(dǎo)將目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中并過量表達(dá)，通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因是否具有提高植物抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎(chǔ)，發(fā)明人將這個基因命名為 lrbhlh1。

5、上述 lrbhlh1基因應(yīng)用于提高煙草的抗真菌能力，具體操作如下：

6、（1）采用擴(kuò)增 lrbhlh1的特異引物，從岷江百合根中提取總rna，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse?transcription-polymerase?chain?reaction，rt-pcr）擴(kuò)增出 lrbhlh1的編碼區(qū)，然后將其連接到pgem-t載體上，經(jīng)測序獲得具有目的基因的克??；

7、（2）用限制性內(nèi)切酶 ecorⅰ和 bamhi酶切pgem-t- lrbhlh1載體，通過膠回收得到目的基因片段，用同樣的內(nèi)切酶酶切植物表達(dá)載體pcambia2300s，膠回收獲得所需載體大片段，再將所獲得 lrbhlh1基因片段與pcambia2300s片段連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體，之后將所構(gòu)建的重組載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)；

8、（3）以重組載體t-dna上具有的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過pcr檢測得到真正的轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因植物抗真菌侵染的能力，最后篩選出對真菌抗性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。

9、本發(fā)明為提高植物對真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物可以克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發(fā)明來自岷江百合的 lrbhlh1基因能增強(qiáng)植物對真菌的抗性，將該基因?qū)霟煵葜?，可以產(chǎn)生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術(shù)培育抗性植物品種和材料具有明顯的優(yōu)勢和不可取代的重要性；它不僅可以為大規(guī)模生產(chǎn)農(nóng)作物、藥材、園藝植物等提供方便，大量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，還可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本、減小環(huán)境污染，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應(yīng)用前景。