本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種單拷貝的糜子基因及利用其檢測(cè)糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，尤其涉及一種能夠檢測(cè)糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的單拷貝的糜子基因及利用數(shù)字pcr和熒光定量pcr檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)基因植物是基因組中含有外源基因的植物。其中，外源基因整合進(jìn)入受體植物基因組的拷貝數(shù)會(huì)影響外源目的基因在受體植株中的表達(dá)及其遺傳穩(wěn)定性。當(dāng)外源基因以單低拷貝（1~2個(gè)）插入到受體的基因組時(shí)，一般能夠穩(wěn)定高效的表達(dá)，而當(dāng)外源基因以多拷貝數(shù)整合到受體基因組時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)水平較低甚至基因沉默，從而無(wú)法得到表現(xiàn)目的性狀的轉(zhuǎn)基因植株。因此，研究人員在挑選轉(zhuǎn)基因t0代株系時(shí)，往往會(huì)選擇單低拷貝整合的轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)的研究。然而，要挑選出單低拷貝整合的轉(zhuǎn)基因t0代株系，往往需要從幾十甚至上百個(gè)轉(zhuǎn)基因t0代株系中鑒定篩選。如果采用傳統(tǒng)的插入拷貝數(shù)檢測(cè)方法，則工作量大，耗時(shí)久且成本高。因此，簡(jiǎn)單、快速、高效、高通量的外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植物育種研究非常重要。

2、傳統(tǒng)的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因插入拷貝數(shù)的方法為southern雜交，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，其準(zhǔn)確性已經(jīng)得到了大家的普遍認(rèn)可，但其對(duì)樣品dna的量與純度要求較高，且成本高，周期長(zhǎng)，難以滿足高通量外源基因插入拷貝數(shù)檢測(cè)的需求。熒光定量pcr也常用于轉(zhuǎn)基因植株中外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)，可分為熒光染料法和探針?lè)?。探針?lè)ㄏ啾扔谌玖戏?，能更精確地對(duì)低拷貝的目的dna片段進(jìn)行定量分析，但探針價(jià)格較昂貴，成本高。染料法雖然相較于探針?lè)ň珳?zhǔn)度稍有降低，但在檢測(cè)單低拷貝外源基因時(shí)的準(zhǔn)確性也足以滿足育種工作需求，其成本較低，更適宜高通量檢測(cè)。目前，熒光定量pcr測(cè)定外源基因插入拷貝數(shù)已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻和棉花等作物的拷貝數(shù)檢測(cè)。數(shù)字pcr技術(shù)是在熒光定量pcr技術(shù)基礎(chǔ)上的一次技術(shù)革新，其分析結(jié)果可直接得出dna分子的個(gè)數(shù)，對(duì)起始樣品進(jìn)行絕對(duì)定量。相比熒光pcr，數(shù)字pcr具有更好的測(cè)量獨(dú)立性，且無(wú)需任何校準(zhǔn)物，具有更高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。研究表明，數(shù)字pcr能夠簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確地測(cè)定水稻、柑橘、馬鈴薯、玉米、番茄和小麥中的外源基因插入拷貝數(shù)。

3、糜子（ panicum?miliaceum?l.）屬禾本科黍?qū)?，起源于我?guó)的黃河流域，是人類最早馴化成功的糧食作物之一，其抗旱性強(qiáng)、生育期短、藥用價(jià)值高，是干旱、半干旱地區(qū)的重要作物。糜子中蛋白質(zhì)含量約為13%，高于小麥、水稻和玉米，且富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，具有保健和藥食同源的功能。糜子有粳糯之分，糯性稱為黍子，主要分布在華北和東北地區(qū)，粳性稱為糜子或稷，主要分布在西北地區(qū)。目前我國(guó)糜子育種既缺少關(guān)鍵性種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、創(chuàng)制和利用，又缺乏現(xiàn)代生物育種的應(yīng)用和指導(dǎo)，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)育種。近年來(lái)，基因工程技術(shù)的發(fā)展，為糜子的育種及品種改良提供了一種快速有效的途徑。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)202111531566.3公開了一種黍?qū)僦参锏倪z傳轉(zhuǎn)化方法，其采用基因槍轟擊法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因糜子。中國(guó)發(fā)明專利202311246503.2公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的糜子高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得了多個(gè)轉(zhuǎn)基因糜子株系。近幾年來(lái)，隨著糜子遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者開始以性狀改良為目的，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因糜子生物育種研究。為了從大量轉(zhuǎn)基因糜子株系中快速篩選出單低拷貝插入整合的轉(zhuǎn)基因糜子株系用于后續(xù)育種研究，亟需建立一種簡(jiǎn)單、快速、高效檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，初步篩選單低拷貝的轉(zhuǎn)基因糜子株系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供的是一種單拷貝的糜子基因及利用其通過(guò)與數(shù)字pcr和熒光定量pcr技術(shù)結(jié)合檢測(cè)糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

3、一種單拷貝的糜子基因，所述單拷貝的糜子基因?yàn)橛糜跈z測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的 sd1基因，該基因?yàn)閜m13g15420，來(lái)自于糜子chr_13染色體；

4、在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的過(guò)程中，所述 sd1基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè) sd1基因的正向引物sd1-f序列如seq?id?no：1所示、反向引物sd1-r序列如seq?id?no：2所示。

5、進(jìn)一步的，在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的過(guò)程中，以 hyg篩選標(biāo)記基因作為外源基因，檢測(cè) hyg篩選標(biāo)記基因的正向引物hyg-f序列如seq?id?no：4所示、反向引物hyg-r序列如seq?id?no：5所示。

6、進(jìn)一步的，在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的判斷方法為：

7、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值或者外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為0.5時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為單拷貝插入（即外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值或者外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為0.26~0.74時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為單拷貝插入）；

8、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值或者外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為1時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為雙拷貝插入（即外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值或者外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為0.75~1.25時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為雙拷貝插入）；

9、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值或者外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為1.5時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為三拷貝插入（即外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值或者外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為1.26~1.74時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為三拷貝插入）；

10、以此類推轉(zhuǎn)基因糜子的其它插入拷貝數(shù)，例如四拷貝插入、五拷貝插入等。

11、一種利用上述單拷貝的糜子基因檢測(cè)糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，所述方法是以 sd1基因作為內(nèi)參基因，以 hyg篩選標(biāo)記基因作為外源基因，利用引物對(duì)sd1-f/sd1-r和引物對(duì)hyg-f/hyg-r，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子的基因組dna，并根據(jù)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值或者外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)，判斷轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)。

12、進(jìn)一步的，轉(zhuǎn)基因糜子的基因組dna是采用數(shù)字pcr技術(shù)或熒光定量pcr技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

13、進(jìn)一步的，采用數(shù)字pcr技術(shù)檢測(cè)過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的判斷方法為：

14、由于糜子是異源四倍體，且內(nèi)參基因在糜子基因組中為單拷貝，外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為0.5時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為單拷貝插入（即外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值為0.26~0.74時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為單拷貝插入）；

15、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為1時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為雙拷貝插入（即外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值為0.75~1.25時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為雙拷貝插入）；

16、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為1.5時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為三拷貝插入（即外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值為1.26~1.74時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為三拷貝插入）；

17、以此類推轉(zhuǎn)基因糜子的其它插入拷貝數(shù)，例如四拷貝插入、五拷貝插入等。

18、進(jìn)一步的，采用數(shù)字pcr技術(shù)檢測(cè)過(guò)程中，利用基因 sd1作為內(nèi)參基因的探針序列如seq?id?no：3所示，利用 hyg篩選標(biāo)記基因作為外源基因的探針序列如seq?id?no：6所示。

19、進(jìn)一步的，所述數(shù)字pcr技術(shù)是使用microdrop微滴式數(shù)字pcr系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)字pcr反應(yīng)；

20、采用數(shù)字pcr技術(shù)檢測(cè)過(guò)程中，以轉(zhuǎn)基因糜子的基因組dna為dna模板，反應(yīng)體系為：微滴式數(shù)字pcr用反應(yīng)預(yù)混液10.00μl、濃度為10.00μm的sd1-f?1.80μl、濃度為10.00μm的sd1-r?1.80μl、濃度為10.00μm的hyg-f?1.80μl、濃度為10.00μm的hyg-r?1.80μl、濃度為10.00μm的探針sd1-p?0.50μl、濃度為10.00μm的探針hyg-p?0.50μl、濃度為50.00ng/μl的dna模板?1μl和無(wú)核酸酶水0.80μl，總體積20.00μl；

21、反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃?10min；95℃?30s，60℃?1min，45個(gè)循環(huán)；98℃?10min；

22、數(shù)字pcr反應(yīng)結(jié)束后，將芯片放入生物芯片分析儀中讀取fam和vic熒光信號(hào)，并使用quantdrop?software進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析，得到檢測(cè)dna模板中外源基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)（copy/μl），計(jì)算轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值，通過(guò)比值判斷外源基因在轉(zhuǎn)基因糜子基因組中的插入拷貝數(shù)。

23、進(jìn)一步的，采用熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的判斷方法為：

24、使用quantstudio??design?&?analysis?software?v1.5.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用法分析轉(zhuǎn)基因糜子中 hyg篩選標(biāo)記基因的相對(duì)拷貝數(shù)，以雙拷貝轉(zhuǎn)基因糜子作為參照因子，即為1，各轉(zhuǎn)基因糜子相對(duì)于參照因子拷貝數(shù)的倍數(shù)為；由于t0代轉(zhuǎn)基因糜子的插入為雜合型，因此雙拷貝轉(zhuǎn)基因糜子的相對(duì)定量值（rq）應(yīng)為雙拷貝參照的1/2，即外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為0.5時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為單拷貝插入（也就是外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為0.26~0.74時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為單拷貝插入）；

25、雙拷貝轉(zhuǎn)基因糜子的rq值與雙拷貝對(duì)照相等，即外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為1時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為雙拷貝插入（也就是外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為0.75~1.25時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為雙拷貝插入）；

26、三拷貝轉(zhuǎn)基因糜子的相對(duì)定量值rq應(yīng)該為雙拷貝對(duì)照的3/2，即外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為1.5時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為三拷貝插入（也就是外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為1.26~1.74時(shí)轉(zhuǎn)基因糜子為三拷貝插入）；

27、以此類推轉(zhuǎn)基因糜子的其它插入拷貝數(shù)，例如四拷貝插入、五拷貝插入等。

28、進(jìn)一步的，采用熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)是以雙拷貝轉(zhuǎn)基因糜子作為參照模板，反應(yīng)在quantstudiotm?1?plus實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，采用法分析轉(zhuǎn)基因糜子中 hyg篩選標(biāo)記基因的相對(duì)拷貝數(shù)；

29、采用熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)過(guò)程中，以轉(zhuǎn)基因糜子的基因組dna為dna模板，擴(kuò)增 sd1基因的反應(yīng)體系為：2?x?qpcr?master?mix?10.00μl、low?rox?dye?0.20μl、濃度為10.00μm的sd1-f?0.40μl、濃度為10.00μm的sd1-r?0.40μl、濃度為50.00ng/μl的dna模板2.00μl和ddh2o?7.00μl，總體積為20.00μl；

30、擴(kuò)增 hyg基因的反應(yīng)體系為：2?x?qpcr?master?mix?10.00μl、low?rox?dye?0.20μl、濃度為10.00μm的hyg-f?0.40μl、濃度為10.00μm的hyg-r?0.40μl、濃度為50.00ng/μl的dna模板?2.00μl和ddh2o?7.00μl，總體積為20.00μl；

31、擴(kuò)增 sd1基因的和 hyg基因的擴(kuò)增程序均為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃?15s，60℃?60s，95℃?15s。

32、本發(fā)明的一種單拷貝的糜子基因及利用其檢測(cè)糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法的有益效果為：

33、本發(fā)明提供了一個(gè)單拷貝的糜子基因，可作為用于轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)的內(nèi)參基因，以轉(zhuǎn)基因糜子中的最常用的篩選標(biāo)記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hygromycin?phosphotransferase， hyg）為外源基因，利用數(shù)字pcr與熒光定量pcr技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的快速高通量檢測(cè)；

34、本發(fā)明提供了一種利用數(shù)字pcr或熒光定量pcr技術(shù)高通量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，具有簡(jiǎn)單快速、樣本要求低、高效、高通量等特點(diǎn)，能夠提高大規(guī)模篩選轉(zhuǎn)基因株系的效率，可為轉(zhuǎn)基因糜子育種研究中外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)提供新的選擇；

35、本發(fā)明提供的一種利用數(shù)字pcr技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，可用于所有以 hyg為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因糜子的拷貝數(shù)檢測(cè)；該方法具有絕對(duì)定量、準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)單快速、樣本需求量少、能批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)；

36、本發(fā)明提供的一種利用熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因糜子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，可用于所有以 hyg為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因糜子的拷貝數(shù)檢測(cè)；該方法具有簡(jiǎn)單快速、成本低、樣本需求量少等優(yōu)點(diǎn)，其準(zhǔn)確性足以滿足檢測(cè)單低拷貝的育種需求，更適合批量檢測(cè)。