本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)及生物工程領(lǐng)域，具體而言，涉及一種預(yù)防病毒性心肌炎的細(xì)菌樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、柯薩奇病毒b組3型(coxsackievirus?b3，cvb3)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，可通過糞口途徑傳播。傳染性強，在世界范圍內(nèi)流行廣泛，可導(dǎo)致病毒性心肌炎(viralmyocarditis，vm)嚴(yán)重危害人類健康。vm是誘發(fā)兒童和青少年心力衰竭的主要原因之一。臨床研究表明，青壯年vm相關(guān)的死亡率高達(dá)21％。急性vm進(jìn)展快、死亡率高。截至2017年，每年約有180萬新發(fā)病例，但目前針對該病仍無特異性治療方法，僅以支持治療為主。研發(fā)中的減毒疫苗和基因工程疫苗也顯示了初步的免疫保護(hù)效果，但并沒有獲得滿意的進(jìn)展。cvb3可經(jīng)黏膜途徑感染導(dǎo)致病毒性心肌炎，那么誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答可能成為預(yù)防與治療cvb3的關(guān)鍵突破口。因此研發(fā)新型cvb3黏膜疫苗對于病毒性心肌炎的預(yù)防具有重要的理論指導(dǎo)意義和社會經(jīng)濟(jì)價值。

2、gem顆粒是一種將食品級乳酸菌經(jīng)熱酸處理，去除原有蛋白質(zhì)、核酸等胞內(nèi)外大分子物質(zhì)而只留下細(xì)胞壁肽聚糖微球，其大小和形態(tài)與活菌相似，因此被稱為細(xì)菌樣顆粒(bacterium-like?particles，blps)。作為新型抗原展示平臺，外源抗原蛋白通過融合錨鉤蛋白(protein?anchor，pa)，加入熱酸預(yù)處理的乳酸菌肽聚糖顆粒中孵育，在pa的幫助下，即可形成抗原展示顆粒。gem的粒徑約1μm，大小能夠通過鼻腔黏膜，因此還被用于黏膜免疫。

3、gem作為黏膜疫苗遞送載體，黏膜是機體的第一道防線，有效的黏膜免疫能夠在病原入侵開始就起到防護(hù)作用，阻止病原進(jìn)一步感染。表面展示呼吸道合胞體病毒(respiratory?syncytial?virus，rsv)f蛋白的疫苗blp-rsv?f通過鼻腔黏膜免疫小鼠或棉鼠，能誘導(dǎo)產(chǎn)生比滅活疫苗更高水平的鼻腔siga和血清中和抗體，受強毒攻擊后能顯著減少肺臟病毒載量，成為預(yù)防rsv安全而有效的候選疫苗。近年來gem顆粒表面展示系統(tǒng)在疫苗研制、佐劑開發(fā)、蛋白純化等方面的廣泛應(yīng)用已充分表明該技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，尤其在黏膜疫苗的研發(fā)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

4、目前關(guān)于cvb3的疫苗研究主要包括減毒活疫苗、滅活疫苗、重組亞單位疫苗、病毒載體疫苗和dna疫苗等，多數(shù)處于臨床前的研究階段。

5、cvb3減毒活疫苗主要包括基因改造減毒型、溫度敏感性減毒型以及插入mirna互補序列的組織特異性減毒型等。cvb3減毒的策略是改造病毒與細(xì)胞受體(coxsackievirusand?adenovirus?receptor，car)之間的結(jié)合區(qū)域氨基酸，降低病毒感染能力。盡管cbv3的減毒活疫苗能夠誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但接種后可能會有毒株毒力恢復(fù)的風(fēng)險。因此，有團(tuán)隊已經(jīng)將目標(biāo)轉(zhuǎn)移到了滅活疫苗的開發(fā)中。傳統(tǒng)方法的滅活疫苗接種后不會在機體內(nèi)恢復(fù)致病性，而且更穩(wěn)定，但免疫原性也往往會降低，需要一種或多種佐劑協(xié)助，才能誘導(dǎo)有效的保護(hù)性反應(yīng)。有研究報道接種滅活的cvb3疫苗的小鼠模型中和抗體滴度很低，在攻毒保護(hù)性試驗中，小鼠存活率約為74％。重組亞單位cvb3疫苗研究較少。目前正在開發(fā)中的疫苗，都有難以兼顧保護(hù)效力和安全性等問題，這意味著在研發(fā)亞單位疫苗時，還需要對其他結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行研究。有學(xué)者將cvb3dna疫苗與vp1重組蛋白疫苗聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)相對于單種類型的疫苗免疫，這兩種不同類型的疫苗聯(lián)合使用能夠更有效地激活機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，提高產(chǎn)生中和抗體的滴度和保護(hù)率。

6、傳統(tǒng)的預(yù)防病毒性心肌炎的細(xì)菌樣顆粒疫苗包括gem顆粒與pa，與pa融合的抗原雖然可以有效穩(wěn)定地錨定在gem顆粒的肽聚糖上，并誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)，但是與pa融合的抗原的免疫效果仍然不是很理想。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、鑒于上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種預(yù)防病毒性心肌炎的細(xì)菌樣顆粒疫苗及其制備方法。

2、本發(fā)明的目的之一是提供融合蛋白vp1-fc，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。所述融合蛋白含有核心組件cvb3衣殼蛋白vp1和新生兒fc受體(neonatal?fc?receptor，fcrn)。

3、cvb3衣殼蛋白vp1是主要的保護(hù)性抗原，它不僅是中和病毒的決定因子，可以直接影響到病毒的抗原性，而且具有與病毒血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性。它既作為腸道病毒屬內(nèi)不同血清分型的依據(jù)，又可以作為小rna病毒科內(nèi)不同屬的分類參考。vp1含有多個t、b細(xì)胞表位，具有很強的免疫原性，是相對較好的疫苗候選靶抗原。

4、新生兒fc受體(neonatal?fc?receptor，fcrn)是igg的轉(zhuǎn)運受體，在很多細(xì)胞中均有表達(dá)，包括上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。fcrn主要有三大功能，即通過胎盤轉(zhuǎn)運母體igg、通過上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運igg及維持血液中igg水平穩(wěn)定。

5、本發(fā)明以融合蛋白vp1-fc作為抗原，利用fcrn介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用穿過黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)入宿主體內(nèi)，從而引起更強烈的局部黏膜免疫與系統(tǒng)性的全身免疫反應(yīng)，進(jìn)一步提高免疫效果。

6、本發(fā)明的目的之二是提供編碼所述融合蛋白vp1-fc的基因，核苷酸序列如seq?idno.2所示。

7、本發(fā)明的目的之三是提供一種預(yù)防病毒性心肌炎的細(xì)菌樣顆粒疫苗，該疫苗是將所述融合蛋白vp1-fc展示在gem顆粒表面獲得。

8、進(jìn)一步的，利用多肽fcsp介導(dǎo)融合蛋白vp1-fc展示在gem顆粒表面，所述多肽fcsp的氨基酸序列為hwrgwv。

9、gem微球表面存在許多游離氨基，這使得通過edc/nhs法在其表面偶聯(lián)多肽具有可行性。多肽介導(dǎo)的抗原展示gem顆粒能夠在維持顆粒以及抗原蛋白的免疫學(xué)活性的同時，最大程度的將抗原蛋白的原表位準(zhǔn)確的展示在gem顆粒外側(cè)。

10、在本發(fā)明的一具體實施方式中，將cvb3?vp1分別與pa、igg?fc基因融合得到vp1-pa融合蛋白、vp1-fc融合蛋白，利用pa介導(dǎo)vp1-pa融合蛋白展示在gem顆粒表面，制成gem顆粒疫苗gem-vp1-pa(圖1b)作為對照，利用多肽fcsp(hwrgwv)介導(dǎo)vp1-fc融合蛋白展示在gem顆粒表面，制成gem顆粒疫苗gem-vp1-fc(圖1a)；同時探究兩種疫苗免疫小鼠效果差異。預(yù)期結(jié)果為多肽在亞單位疫苗的研發(fā)提供了新的思路，為開發(fā)具有良好免疫原性且無安全隱患的cvb3候選疫苗提供新的策略、新的方法，為預(yù)防病毒性心肌炎提供技術(shù)支撐。

11、本發(fā)明的目的之四是提供所述的預(yù)防病毒性心肌炎的細(xì)菌樣顆粒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

12、合成核苷酸序列如seq?id?no.2所示的基因，將pcdna3.1(+)質(zhì)粒線性化后與該基因連接，得到重組載體；

13、將所述重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞，通過培養(yǎng)和表達(dá)，純化得到氨基酸序列如seqid?no.1所示的融合蛋白vp1-fc；

14、通過三氯乙酸制備乳酸乳球菌mg1363的gem顆粒，將所述gem顆粒、fcsp溶液和融合蛋白vp1-fc混合重懸，得到預(yù)防病毒性心肌炎的細(xì)菌樣顆粒疫苗。

15、進(jìn)一步的，所述宿主細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞。

16、本發(fā)明的目的之五是提供所述的細(xì)菌樣顆粒疫苗在制備防病毒性心肌炎的藥物中的應(yīng)用。

17、進(jìn)一步的，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔料包括常規(guī)的稀釋劑，所述藥物的劑型為滴鼻劑、肌肉注射劑、皮下注射劑或口服劑。

18、有益效果：

19、本發(fā)明提供的基于gem顆粒表面展示系統(tǒng)的cvb3疫苗(gem-fc-vp1疫苗)具有良好的免疫原性，能激起機體強烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，優(yōu)于傳統(tǒng)的顆粒疫苗gem-pa-vp1，gem-fc-vp1疫苗可有效預(yù)防病毒性心肌炎的發(fā)生，比gem-pa-vp1組的免疫效果更好，本發(fā)明為亞單位疫苗的研發(fā)提供了新的思路，為預(yù)防病毒性心肌炎提供新的策略。