本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種增強(qiáng)secd和ftsy基因轉(zhuǎn)錄水平的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，ec?2.3.2.13）能夠使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，可以改善肉制品的外觀、口感、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)特性；可以提升酸奶品質(zhì)，提高植物蛋白的彈性和持水能力；此外，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶還可以用于制備薄膜，替代高分子合成材料制造的食品包裝薄膜。因此，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在食品加工、包裝等領(lǐng)域具有極其廣泛的應(yīng)用前景。

3、根據(jù)來(lái)源不同谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以分為兩類，來(lái)源于動(dòng)植物組織的稱為組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（tissuetransglutaminase，ttgase），來(lái)源于微生物發(fā)酵制備的稱為微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（microbialtransglutaminase，mtgase）。隨著市場(chǎng)需求的增長(zhǎng)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的規(guī)?；a(chǎn)制備受到了廣泛的關(guān)注。由鏈霉菌屬（ s.mobaraensis）發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是合成谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的主流方法，但仍存在著較大的發(fā)展?jié)摿吞嵘臻g。目前，關(guān)于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶研究處于蓬勃發(fā)展階段，且多集中在菌株發(fā)酵條件、產(chǎn)物提取純化等方面，而高效菌株的選育一直是行業(yè)內(nèi)的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)secd和ftsy基因轉(zhuǎn)錄水平的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株及其制備方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株，在茂原鏈霉菌中過(guò)表達(dá)secd（sec-dependent?translocase?subunit?d）基因和/或ftsy（filamentoustemperature-sensitive?y）基因。

4、在一種或多種實(shí)施方式中，一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株，是在茂原鏈霉菌中過(guò)表達(dá)secd基因，所述secd基因的序列如seq?id?no.1所示。

5、上述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株中，過(guò)表達(dá)secd基因的方法是將secd基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表達(dá)質(zhì)粒中的啟動(dòng)子之后進(jìn)行表達(dá)；

6、所述在茂原鏈霉菌中過(guò)表達(dá)secd基因的方法包括：

7、將含有secd的編碼基因的片段導(dǎo)入所述茂原鏈霉菌中；

8、所述secd的編碼基因的片段是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；

9、所述重組表達(dá)載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點(diǎn)間得到的；

10、所述重組表達(dá)載體具體構(gòu)建方法包括：將含有secd的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點(diǎn)間，得到質(zhì)粒i；

11、在一種或多種實(shí)施方式中，一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株，在茂原鏈霉菌中過(guò)表達(dá)ftsy基因，所述ftsy基因的序列如seq?id?no.2所示。

12、上述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株中，過(guò)表達(dá)ftsy基因的方法是將ftsy基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表達(dá)質(zhì)粒中的啟動(dòng)子之后進(jìn)行表達(dá)。

13、所述在茂原鏈霉菌中過(guò)表達(dá)ftsy基因的方法包括：

14、將含有ftsy的編碼基因的片段導(dǎo)入所述茂原鏈霉菌中；

15、所述ftsy的編碼基因的片段是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；

16、所述重組表達(dá)載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點(diǎn)間得到的；

17、所述重組表達(dá)載體具體構(gòu)建方法包括：將含有ftsy的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點(diǎn)間，得到質(zhì)粒ii。

18、上述任一所述的茂原鏈霉菌為茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl。

19、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，包括：

20、將含有secd的編碼基因和/或ftsy的編碼基因的片段導(dǎo)入所述茂原鏈霉菌中，獲得過(guò)表達(dá)secd基因和/或ftsy基因的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株；

21、所述secd基因的序列如seq?id?no.1所示；

22、所述ftsy基因的序列如seq?id?no.2所示。

23、在一種或多種實(shí)施方式中，一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，包括：將含有secd的編碼基因的片段導(dǎo)入所述茂原鏈霉菌中，獲得過(guò)表達(dá)secd基因的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株。

24、所述secd的編碼基因的片段是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；

25、所述重組表達(dá)載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點(diǎn)間得到的；

26、所述重組表達(dá)載體具體構(gòu)建方法包括：將含有secd的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點(diǎn)間，得到質(zhì)粒i。

27、在一種或多種實(shí)施方式中，一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，包括：將含有ftsy的編碼基因的片段導(dǎo)入所述茂原鏈霉菌中，獲得過(guò)表達(dá)ftsy基因的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株。

28、所述ftsy的編碼基因的片段是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；

29、所述重組表達(dá)載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點(diǎn)間得到的；

30、所述重組表達(dá)載體具體構(gòu)建方法包括：將含有ftsy的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點(diǎn)間，得到質(zhì)粒ii。

31、在一種或多種實(shí)施方式中，上述任一所述的茂原鏈霉菌為茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl。

32、本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供上述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株在制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶中的應(yīng)用。

33、本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供一種制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法，包括：

34、將上述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株活化，獲得谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株孢子，將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培育獲得谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

35、在一種或多種實(shí)施方式中，活化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基中包括：可溶性淀粉20g/l，kno31?g/l，nacl?0.5?g/l，k2hpo4?3h2o0.5?g/l，mgso4?7h2o?0.5?g/l，feso4?7h2o?0.01?g/l，瓊脂20?g/l。

36、在一種或多種實(shí)施方式中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上活化的溫度為28~32?℃，優(yōu)選為30?℃，時(shí)間為5~7天。

37、在一種或多種實(shí)施方式中，種子培養(yǎng)基包括：甘油20?g/l，蛋白胨20?g/l，酵母粉5g/l，mgso4·7h2o?2?g/l，k2hpo42?g/l，kh2po42?g/l；種子培養(yǎng)基的ph為7.0。

38、在一種或多種實(shí)施方式中，將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液的條件包括：培養(yǎng)溫度為28~32?℃，優(yōu)選為30?℃；搖床頻率為180~220rpm，優(yōu)選為200?rpm；培養(yǎng)時(shí)間為20~30?h，優(yōu)選為24?h。

39、優(yōu)選的，種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為8%~15%（體積比），優(yōu)選為10%（體積比）。

40、在一種或多種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括：甘油20?g/l，蛋白胨20?g/l，酵母粉5g/l，玉米漿干粉20?g/l，kh2po44?g/l，k2hpo42?g/l，mgso4·7h2o?2?g/l，nh4cl?3.2?g/l；發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為7.0。

41、在一種或多種實(shí)施方式中，發(fā)酵培育時(shí)的培育條件包括：培養(yǎng)溫度為28~32?℃，優(yōu)選為30?℃；搖床頻率為180~220?rpm，優(yōu)選為200?rpm。

42、本發(fā)明的有益效果在于：

43、在茂原鏈霉菌發(fā)酵過(guò)程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在胞內(nèi)以前體蛋白加信號(hào)肽即pre-pro-tgase形式存在，通過(guò)跨膜運(yùn)輸，識(shí)別并切割信號(hào)肽，以酶原（pro-tgase）的形式分泌到細(xì)胞外，再由胞外的金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶激活，形成有活力的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。研究表明，分泌蛋白利用sec（secretion）通路和信號(hào)識(shí)別顆粒（signal?recognitionparticle，srp）等途徑透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜，因此過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的secd基因或ftsy基因，有可能提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，進(jìn)而加快谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分泌?；诖?，本發(fā)明在茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl中過(guò)表達(dá)與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的secd基因或ftsy基因，構(gòu)建突變菌株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于原始茂原鏈霉菌 streptomyces? mobaraensisgl，將含有secd的編碼基因的片段導(dǎo)入所述茂原鏈霉菌 streptomyces? mobaraensisgl中形成的突變株gl-p1以及將含有ftsy的編碼基因的片段導(dǎo)入所述茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl中形成的突變株gl-p2均可以大幅提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)量。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶水平下突變株的產(chǎn)量對(duì)比野生型菌株分別提高37.47%、64.5%。