本發(fā)明涉及生物，尤其涉及第一基因片段和第二基因片段的用途、引物組和探針、試劑盒及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、貓細(xì)小病毒（feline?parvovirus，fpv）又稱貓泛白細(xì)胞減少癥病毒，俗稱貓瘟病毒，該病毒可引起貓的發(fā)熱、嘔吐、出血性腸炎和白細(xì)胞減少等癥狀，致死率較高。犬細(xì)小病毒（canine?parvo?virus，cpv）可導(dǎo)致腸胃炎和心肌炎，發(fā)病速度快、死亡率高，隨著病毒抗原漂移，該病毒還可以感染貓、小熊、貂等動(dòng)物。貓細(xì)小病毒（feline?parvovirus，fpv）和犬細(xì)小病毒（canine?parvovirus，cpv）是親緣關(guān)系密切的兩種細(xì)小病毒，都屬于細(xì)小病毒科，原細(xì)小病毒屬，肉食動(dòng)物原細(xì)小病毒1型種的成員，為單股dna病毒。近年來(lái)，貓感染犬小病毒病時(shí)有發(fā)生，由于貓細(xì)小病毒在貓上感染的臨床癥狀與犬細(xì)小病毒感染相似，在出現(xiàn)急性病毒性出血性腸炎的貓的診斷上多半會(huì)忽略排除犬細(xì)小病毒感染的可能性，因此造成治愈率較低的情況。貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒混合感染動(dòng)物時(shí)，從臨床癥狀上難以做出鑒別診斷，必須借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段確診。

2、通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離貓細(xì)小和犬細(xì)小病毒是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)方法，雖然具有高度特異性，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且昂貴，而且需要熟練的專業(yè)人員，因此應(yīng)用范圍窄。目前已開(kāi)發(fā)出多種免疫學(xué)方法用于直接鑒定，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）、乳膠凝集試驗(yàn)（lat）、血凝試驗(yàn)（ha）、熒光抗體試驗(yàn)（fat）等。這些實(shí)驗(yàn)室方法大多用于檢測(cè)特異性抗原或抗體，有資料顯示fpv與cpv同源性達(dá)98%以上。cpv和fpv可產(chǎn)生交叉免疫性和血清學(xué)交叉反應(yīng)，所以免疫學(xué)的方法均存在靈敏度低和特異性不好的問(wèn)題，無(wú)法鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒。pcr技術(shù)可用于擴(kuò)增無(wú)法培養(yǎng)的病原體，由于pcr檢測(cè)是設(shè)計(jì)與病原序列完全匹配的特異性引物序列，因此具有高度特異性，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)目標(biāo)基因。

3、進(jìn)化分析數(shù)據(jù)顯示，cpv與fpv序列同源性高，vp2基因僅存在0.5?%的差異性，有報(bào)道認(rèn)為它們可能來(lái)源于同一個(gè)祖先適應(yīng)不同的宿主進(jìn)化而來(lái)。cpv可以感染貓，但是fpv至今為止未有感染犬的報(bào)道；并且多例研究報(bào)道了cpv和fpv混合感染貓的情況。針對(duì)貓細(xì)小和犬細(xì)小病毒的鑒別診斷方法，現(xiàn)有的技術(shù)如下：

4、可應(yīng)用dna?測(cè)序和利用單克隆抗體的血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行fpv和cpv的鑒別，前者需要提取病毒dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并且一般需要送公司測(cè)序，比較耗時(shí)耗力，后者需要多種單克隆抗體，不適用于普遍使用。

5、decaro等以單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)g3752a為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，建立了能夠鑒別檢測(cè)fpv和cpv?dna的taqman?mgb?real?time?pcr方法（decaro?et?al.,?2008）。但序列的保守性非常影響試驗(yàn)結(jié)果，最近中國(guó)報(bào)道hb3毒株?（genbank?no.kt162043）3752堿基位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致單核酸突變無(wú)法鑒別。

6、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的孫亞茹在其學(xué)位論文《不同抗原型犬細(xì)小病毒及其與貓細(xì)小病毒分子鑒別方法的建立及初步應(yīng)用》中通過(guò)genbank上下載所有fpv和cpv基因組全序列，利用mega7進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)穩(wěn)定snp?a4408c位點(diǎn)，并且該位點(diǎn)附近為保守片段。設(shè)計(jì)一對(duì)引物f1/r1擴(kuò)增包含該突變位點(diǎn)的361bp大小的保守片段，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；設(shè)計(jì)一對(duì)引物f2/r2，建立了鑒別fpv和cpv的qpcr-hrm方法，但該方法需要使用昂貴的pcr儀及分析軟件，且qpcr-hrm反應(yīng)擴(kuò)增程序大約需要2?h，耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合寵物醫(yī)院使用，并且通過(guò)分析序列發(fā)現(xiàn)，該方法中的特異性引物無(wú)法鑒別fpv和cpv；

7、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification?refractorymutation?system，arms）技術(shù)是newton等首先建立用來(lái)檢測(cè)已知突變的方法。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的鑒別檢測(cè)方法arms-qpcr的基本原理利用引物的3’端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，用dna聚合酶無(wú)法延伸，而與模板堿基互補(bǔ)引物，用dna聚合酶正常延伸。再結(jié)合熒光探針檢測(cè)可以進(jìn)行對(duì)snp位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光鑒別檢測(cè)。目前此法已用于多種疾病的點(diǎn)突變的檢測(cè)，也開(kāi)始應(yīng)用于病原的鑒別檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)時(shí)的堿基類型對(duì)pcr的擴(kuò)增具有極大的影響，引物的3’端引入不同堿基類型的錯(cuò)配，擴(kuò)增效率不一致，引物3’端g變?yōu)閏，t變?yōu)間以及c變?yōu)閍的擴(kuò)增效率最低，極大地阻礙了擴(kuò)增，在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)可利用這點(diǎn)為引物設(shè)計(jì)的特異性提供參考。有其研究表明，引物與模板之間的堿基結(jié)合為c-c，g-a，a-g，a-a時(shí)，結(jié)合率最低，擴(kuò)增反應(yīng)阻礙最明顯。

8、taqman探針是一種雙標(biāo)記、自淬滅的水解探針，其5’和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)兩者距離較近，熒光基團(tuán)的信號(hào)可被淬滅。而在pcr擴(kuò)增過(guò)程中，若taqman探針與靶標(biāo)序列完全匹配，探針則可結(jié)合在dna模板上，此時(shí)taq酶延伸至探針位置時(shí)，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團(tuán)，使得熒光信號(hào)增強(qiáng)。而且，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增多，熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，從而可通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化過(guò)程。針對(duì)雙等位基因snp，可分別設(shè)計(jì)兩種對(duì)應(yīng)的探針，只有探針與模板完全匹配時(shí)，在擴(kuò)增過(guò)程中探針可被水解產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而如果探針與靶序列之間存在錯(cuò)配，其熒光強(qiáng)度將會(huì)減弱，由此可通過(guò)熒光強(qiáng)度檢測(cè)snp位點(diǎn)。探針檢測(cè)能夠容忍的核苷酸錯(cuò)配個(gè)數(shù)為6個(gè)，且探針中間的位置比探針兩端更為敏感，tm值下降更快，探針發(fā)生核苷酸錯(cuò)配時(shí)，其對(duì)擴(kuò)增效率影響不大，影響的主要是tm值的變化，當(dāng)錯(cuò)配增加到一定個(gè)數(shù)時(shí)，擴(kuò)增曲線將直接表現(xiàn)為陰性。

9、現(xiàn)有技術(shù)1：中國(guó)專利申請(qǐng)cn202111628075.0公開(kāi)了一種貓和/或犬病原體的pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用，該方案的試劑盒包括用于檢測(cè)犬瘟熱病毒、檢測(cè)犬甲型流感病毒、犬副流感病毒、犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬巴貝斯蟲(chóng)、犬蛔蟲(chóng)、犬埃立克體、犬布魯氏菌、狂犬病病毒、伯氏疏螺旋體、內(nèi)參基因actb、貓皰疹病毒、貓杯狀病毒、貓細(xì)小病毒、貓冠狀病毒、貓免疫缺陷病毒、貓白血病病毒、貓血支原體、貓支原體、貓衣原體、賈第鞭毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、巴爾通體和內(nèi)參基因gapdh的引物及探針，將采集貓犬dna和rna加入該試劑盒，采用實(shí)時(shí)熒光pcr儀進(jìn)行pcr反應(yīng)，每一循環(huán)采集fam、hex、rox和cy5熒光信號(hào)，進(jìn)行相關(guān)病原體的分析，較傳統(tǒng)檢測(cè)方法特異性更強(qiáng)、靈敏度更高；

10、進(jìn)一步觀察該方案的說(shuō)明書可見(jiàn)，雖然本方案能夠同時(shí)檢測(cè)多種病毒，但測(cè)試過(guò)程中所使用的引物和探針均存在區(qū)別，即每種病毒均采用了其具有高特異性的片段進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)進(jìn)行擴(kuò)增。

11、現(xiàn)有技術(shù)2：中國(guó)專利申請(qǐng)cn202310047212.4公開(kāi)了一種貓犬病原體快速檢測(cè)的方法、引物組合物及試劑盒，以解決現(xiàn)有寵物病原體檢測(cè)方法存在的檢測(cè)準(zhǔn)確度低，且成本高，或者是檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)，且器械設(shè)備費(fèi)用十分高昂等技術(shù)問(wèn)題。

12、該方法包括：

13、1、采集待檢測(cè)的病原體樣本；

14、2、樣本經(jīng)核酸純化或裂解液直接裂解處理；

15、3、擴(kuò)增反應(yīng)；3?.1、針對(duì)每一個(gè)待檢測(cè)的病原體確定特異性的引物組并設(shè)計(jì)擴(kuò)增體系；

16、3、將步驟2處理后的樣本以及對(duì)應(yīng)的引物組加入擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；

17、4、可視化檢測(cè)；觀察擴(kuò)增反應(yīng)后反應(yīng)液的顏色是否變化，若有顏色變化，則感染相應(yīng)的病原體，若沒(méi)有顏色變化，則未感染相應(yīng)的病原體。

18、進(jìn)一步觀察該方案可見(jiàn)，該方案盡管能夠同時(shí)檢測(cè)包括貓細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒在內(nèi)的多種病毒，但該方案同時(shí)針對(duì)不同病毒的特異性片段設(shè)計(jì)了不同的擴(kuò)增體系，并將多個(gè)擴(kuò)增體系融合，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多種病毒的檢測(cè)；

19、綜上可見(jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中，盡管具有能同時(shí)檢測(cè)多種病毒的試劑盒，但上述試劑盒均是根據(jù)多個(gè)病毒的特異性片段設(shè)計(jì)其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物，并且由于多個(gè)病毒的特異性片段的差別較大，因此在檢測(cè)過(guò)程中，多組引物、探針之間難免產(chǎn)生拮抗作用進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差。

20、本技術(shù)需要解決的問(wèn)題：如何通過(guò)fpv和cpv中相似度較高的片段進(jìn)行引物、探針的設(shè)計(jì)，并且在檢測(cè)過(guò)程中能夠區(qū)分fpv和cpv。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的是提供一種用于快速鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的引物組和探針，由于引物組和探針在設(shè)計(jì)過(guò)程中參考的第一基因片段和第二基因片段的高度相似性，本技術(shù)中的引物和探針之間產(chǎn)生的拮抗作用較小，并且仍能夠?qū)崿F(xiàn)貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的有效篩分。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)公開(kāi)了通過(guò)貓細(xì)小病毒的第一基因片段和犬細(xì)小病毒的第二基因片段制備用于快速鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的引物組和探針的用途；

3、所述第一基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

4、所述第二基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、此外，本技術(shù)還公開(kāi)了一種用于快速鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的引物組和探針，所述引物組包括第一引物組、第二引物組；

6、所述第一引物組通過(guò)對(duì)貓細(xì)小病毒的第一基因片段設(shè)計(jì)得到；

7、所述第二引物組通過(guò)對(duì)犬細(xì)小病毒的第二基因片段設(shè)計(jì)得到；

8、所述第一引物組包括第一上游引物、第一下游引物；

9、所述第二引物組包括第二上游引物、第二下游引物；

10、所述第一上游引物與第二上游引物或第一下游引物與第二下游引物中的至少一組核苷酸序列不完全相同；

11、所述探針包括與第一基因片段中的特異性片段對(duì)應(yīng)的第一探針、與第二基因片段中的特異性片段對(duì)應(yīng)的第二探針。

12、優(yōu)選地，所述第一上游引物與第二上游引物的核苷酸序列不完全相同，所述第一下游引物與第二下游引物的核苷酸序列相同。

13、優(yōu)選地，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

14、所述第二上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

15、所述第一下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

16、所述第一探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

17、所述第二探針的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

18、此外，本技術(shù)還公開(kāi)了一種用于快速鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的試劑盒，含有如上所述的用于快速鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的引物組和探針；

19、所述引物組和探針以反應(yīng)液的形式添加至試劑盒內(nèi)，所述反應(yīng)液還包括5×mdx140?mix、滅菌水。

20、優(yōu)選地，所述反應(yīng)液具體包括4μl的5×mdx140?mix，1μl的第一上游引物，1μl的第二上游引物，2μl的第一下游引物，0.5μl的第一探針，0.5μl的第二探針，10μl的滅菌水。

21、優(yōu)選地，所述試劑盒由反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品組成，所述陽(yáng)性對(duì)照品為含有第一基因片段的第一質(zhì)粒、含有第二基因片段的第二質(zhì)粒的混合質(zhì)粒的稀釋液，所述稀釋液由第一質(zhì)粒、第二質(zhì)粒制得的混合質(zhì)粒稀釋至106copies/μl制得，且第一質(zhì)粒與第二質(zhì)粒的質(zhì)量比為1：1；

22、所述陰性對(duì)照品為ddh2o。

23、優(yōu)選地，所述試劑盒具體包括19μl/管的反應(yīng)液共10管，50μl/管的陽(yáng)性對(duì)照品共1管，50μl/管的陰性對(duì)照品共1管。

24、此外，本技術(shù)還公開(kāi)了一種用于構(gòu)建上述的用于快速鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的試劑盒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

25、步驟1：篩選得到第一基因片段、第二基因片段；

26、步驟2：根據(jù)第一基因片段、第二基因片段中核苷酸序列相同的部分設(shè)計(jì)得到第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物；

27、步驟3：根據(jù)第一基因片段中的特異性片段設(shè)計(jì)得到第一探針，根據(jù)第二基因片段中的特異性片段設(shè)計(jì)得到第二探針；

28、步驟4：將第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物、第一探針、第二探針制成反應(yīng)液并與陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品混合，得到用于快速鑒別貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的試劑盒。

29、本技術(shù)的有益效果是：一方面本技術(shù)的引物組和探針可對(duì)貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒進(jìn)行快速鑒別診斷，利用qpcr直擴(kuò)檢測(cè)方法，極大縮短了檢測(cè)所需的時(shí)間，直接加樣本，只需通過(guò)一步熒光觀測(cè)，無(wú)需測(cè)序，可快速進(jìn)行鑒別貓細(xì)小和犬細(xì)小病毒的診斷；

30、另一方面，本技術(shù)的qpcr方法利用貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒差異大的靶點(diǎn)作為特異性靶標(biāo)，采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification?refractory?mutation?system,arms）技術(shù)與taqman雙等位基因snp結(jié)合的方法對(duì)貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的檢測(cè)，具有較高的特異性；

31、并且由于引物組和探針在設(shè)計(jì)過(guò)程中參考的第一基因片段和第二基因片段的高度相似性，本技術(shù)中的引物和探針之間產(chǎn)生的拮抗作用較小，且仍能夠?qū)崿F(xiàn)貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒的有效篩分。