本發(fā)明屬于生物催化，具體涉及一種催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化的突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、木質(zhì)素是在陸地植物中發(fā)現(xiàn)的含量豐富卻未被充分利用的無定型芳香族聚合物，其結(jié)構(gòu)單元是4-羥?基苯丙烷（單酚），根據(jù)芳環(huán)上甲氧基數(shù)目和取代位置的不同，可分為4-羥基苯基（h），愈創(chuàng)木酰基（g）和丁香基（s）。作為自然界中最豐富的可再生芳香族聚合物，地球上的植物每年約生產(chǎn)5-36?億噸木質(zhì)素，此外，作為最大的利用植物生物質(zhì)為原料的化學(xué)工藝行業(yè)，紙漿和造紙業(yè)每年產(chǎn)生約6000萬噸木質(zhì)素“廢物”，如此龐大的木質(zhì)素輸出，其降解對(duì)自然界碳循環(huán)具有不可忽視的影響，但由于木質(zhì)素具有異質(zhì)性，大多數(shù)生物體難以對(duì)其進(jìn)行降解。因此尋找一種高效的木質(zhì)素降解機(jī)制對(duì)環(huán)境保護(hù)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。

2、目前關(guān)于木質(zhì)素降解的方法主要是物理化學(xué)法和生物法。其中物理化學(xué)降解過程存在高耗能和“二次污染”的弊端，無法滿足綠色經(jīng)濟(jì)的發(fā)展需求，相比之下，生物降解因其作用條件溫和、來源廣泛、無污染等優(yōu)勢(shì)脫穎而出，成為近年來木質(zhì)素降解的熱門領(lǐng)域。微生物降解法因作用條件溫和、來源廣泛、無污染等優(yōu)勢(shì)成為近年來木質(zhì)素降解再利用的熱門策略，該策略利用腐爛真菌和某些細(xì)菌分泌的強(qiáng)大氧化酶將木質(zhì)素聚合物分解為小片段，然后再通過至少四種分解代謝方法進(jìn)一步降解為碳和能源。木質(zhì)素主要由愈創(chuàng)木酰基（g）和丁香基（s）兩種結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，它們?cè)诒江h(huán)上分別具有一個(gè)和兩個(gè)甲氧基，因此，幾乎所有木質(zhì)素芳香醚單體都必須先進(jìn)行脫甲基化反應(yīng)生成相應(yīng)的二醇中間物，然后才能將其氧化裂解生成開環(huán)化合物，從而參與到碳循環(huán)過程。因此，脫甲基化是天然碳循環(huán)以及新興生物技術(shù)中利用木質(zhì)素的關(guān)鍵反應(yīng)。2018年，mallinson等人全面表征了一種二組份蛋白p450?脫甲基酶，該酶由?cyp255a?家族的細(xì)胞色素p450酶（gcoa）和三結(jié)構(gòu)域還原酶（gcob）組成，可有效催化多種木質(zhì)素衍物的脫甲基，但是gcoab在反應(yīng)過程中需要消耗昂貴的nad(p)h，若用h2o2作為氧來源不僅可以大大縮短催化循環(huán)路徑，也可降低成本投入。cong課題組創(chuàng)新性提出了雙功能小分子（dfsm）驅(qū)動(dòng)的h2o2依賴型p450bm3過加氧酶，該體系可利用h2o2代替o2作為氧原子供體，催化非天然底物的氧化反應(yīng)。在細(xì)胞色素p450酶龐大的家族中，僅有少數(shù)特定p450能夠選擇性的催化芳香醚發(fā)生脫甲基化反應(yīng)，大多數(shù)p450表現(xiàn)出多種氧化功能。之前，對(duì)雙功能小分子（dfsm）促進(jìn)的人工p450bm3過加氧酶系統(tǒng)的活性空間實(shí)現(xiàn)改造，構(gòu)建得p450bm3/dfsm系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了木質(zhì)素g-木質(zhì)素脫甲基活性的提高。但仍存在對(duì)s-木質(zhì)素（2，6-二甲氧基苯酚）單脫甲基化催化的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化的p450突變酶。本發(fā)明采用p450bm3-aldo體系研究p450突變酶催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化的突變體，突變體為細(xì)胞色素p450bm3氧化酶第87位苯丙氨酸處的位點(diǎn)突變；所述第87位苯丙氨酸處位點(diǎn)突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼?；?xì)胞色素p450bm3氧化酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4、所述突變體還可疊加于細(xì)胞色素p450bm3氧化酶的下述氨基酸位點(diǎn)中的一個(gè)或幾個(gè)進(jìn)行突變：下述第78位纈氨酸處、第328位丙氨酸和第268位蘇氨酸處。

5、進(jìn)一步的說，利用雙功能小分子化合物im-c6-phe誘導(dǎo)所述p450酶的氧化結(jié)構(gòu)域突變體實(shí)現(xiàn)利用甘油氧化生成的h2o2高效催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化；其中，突變體為含所述第78位、第87位、第268位和第328位進(jìn)行突變的單、二、三或四突變體，所述第87位苯丙氨酸突變?yōu)楦拾彼峄虮彼?，?8位纈氨酸突變?yōu)楦拾彼峄虮彼幔?68位蘇氨酸變?yōu)楦彼峄蛱於彼?，?28位丙氨酸突變?yōu)楸奖彼幔痪唧w的突變體為:將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替換為丙氨酸或甘氨酸；所得突變體依次命名為f87a（seq?id?no.3）、f87g（seq?id?no.4）。

6、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替換為丙氨酸，第78位的纈氨酸替換為甘氨酸或丙氨酸，第268位的蘇氨酸替換為天冬酸；所的突變體依次命名為f87a/v78a（seq?id?no.5）、f87a/v78g（seq?id?no.6）、f87a/t268d（seq?id?no.7）。

7、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替換為丙氨酸，第78位的纈氨酸替換為甘氨酸或丙氨酸，氨基酸序列的第268位的丙氨酸替換為脯氨酸或天冬氨酸，第328位丙氨酸替換為苯丙氨酸；所的突變體依次命名為f87a/v78a/t268p（seq?id?no.8）、f87a/v78g/t268p（seq?id?no.9）、f87a/t268d/a328f（seq?id?no.10）。

8、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替換為丙氨酸，第78位的纈氨酸突變?yōu)楸彼?，氨基酸序列的?68位的丙氨酸突變?yōu)樘於彼?，?28位的丙氨酸突變?yōu)楸奖彼岚彼?；所的突變體命名為f87a/v78a/t268d/a328f(seq?id?no.11)。

9、一種表達(dá)載體，表達(dá)載體含所述任意一項(xiàng)突變體的基因。

10、一種基因工程菌，基因工程菌含有所述的表達(dá)載體。

11、一種突變體的應(yīng)用，所述突變體在催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化。

12、所述催化體系為雙功能小分子化合物、所述突變體、甘油、糖醇氧化酶(aldo)和底物；其中，雙功能小分子化合物為n-(ω-咪唑基，脂肪?；?-l-苯丙氨酸衍生物。

13、作為具體的實(shí)施方式，利用所述突變體協(xié)同選擇性催化以愈創(chuàng)木酚、2，6-二甲氧基苯酚為底物o-脫甲基的方法，利用具有雙功能的小分子n-(ω-咪唑基，脂肪?；?-l-苯丙氨酸衍生物誘導(dǎo)所述p450酶的氧化結(jié)構(gòu)域突變體，實(shí)現(xiàn)通過aldo氧化甘油持續(xù)性h2o2分別催化愈創(chuàng)木酚和2，6-二甲氧基苯酚脫甲基生成鄰苯二酚和焦棓酸、3-甲氧基鄰苯二酚。

14、進(jìn)一步地說，利用雙功能小分子化合物im-c6-phe誘導(dǎo)所述p450酶的氧化結(jié)構(gòu)域突變體實(shí)現(xiàn)通過糖醇氧化酶（alcohol?oxidase，簡寫aldo）氧化甘油持續(xù)性利用h2o2分別催化愈創(chuàng)木酚和2，6-二甲氧基苯酚脫甲基生成鄰苯二酚和焦棓酸、3-甲氧基鄰苯二酚；其中，突變體為含所述第87位、第78位、第328位和第268位進(jìn)行突變的單、二、三或四的突變體，所述第87位苯丙氨酸突變?yōu)楦拾彼峄虮彼?，?8位纈氨酸突變?yōu)楦拾彼峄虮彼?，?68位蘇氨酸變?yōu)楦彼峄蛱於彼幔?28位丙氨酸突變?yōu)楸奖彼?；所述催化反?yīng)體系為向反應(yīng)體系為1?ml的磷酸鈉緩沖液（100?mm、ph?8.0）中依次加入4?mm底物、0.5?μm?p450bm3系列突變體、0.5?mm?雙功能小分子，1%v/v甘油，25?℃孵育5?min后加入2.5?μm?aldo，反應(yīng)90min。

15、上述底物為愈創(chuàng)木酚和2，6-二甲氧基苯酚。

16、本發(fā)明通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)與雙功能小分子協(xié)同策略的雙重調(diào)控能力相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)愈創(chuàng)木酚和2，6-二甲氧基苯的綠色高效轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了p450bm3催化體系的優(yōu)化和底物范圍的拓展，為生物催化領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供了新的思路和方法。

17、具體是：以來源于巨大芽孢桿菌的細(xì)胞色素p450-bm3單加氧酶氧化酶部分為模板，利用含有87突變位點(diǎn)的突變引物進(jìn)行pcr突變，測(cè)序獲得f87單突變體；然后以單突變體基因?yàn)槟０澹酝瑯拥姆椒╬cr擴(kuò)增出f87-v78組合和f87-t268組合雙突變體；然后以雙突變體基因?yàn)槟０?，以同樣的方法pcr擴(kuò)增出f87-v78-t268組合和f87-t268-a328三突變體，然后以三突變體基因?yàn)槟０?，以同樣的方法pcr擴(kuò)增出f87-v78a-t268-a328，以此p450bm3-aldo系統(tǒng)催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化效果大幅提升。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與p450bm3-h2o2系統(tǒng)相比，催化效率高達(dá)原系統(tǒng)的5倍。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

19、本發(fā)明通過對(duì)p450bm3定向進(jìn)化，利用隨機(jī)突變高通量篩選獲取催化催化木質(zhì)素芳香醚單體o-脫甲基化的優(yōu)勢(shì)突變體，通過對(duì)優(yōu)勢(shì)突變位點(diǎn)的半理性設(shè)計(jì)，構(gòu)建“小而精”的突變體文庫，提高了篩選效率，在p450bm3-aldo體系下，f87a/v78a/t268d/a328f突變體對(duì)愈創(chuàng)木酚的選擇性高達(dá)99.9%（ton=1895），具有最高的周轉(zhuǎn)次數(shù)。同時(shí)，f87a/t268d突變體對(duì)2,6-二甲氧基苯酚的轉(zhuǎn)化率最高（ton=483），并成功地實(shí)現(xiàn)了雙脫甲基?？傊?，我們認(rèn)為可以通過蛋白質(zhì)工程進(jìn)一步提高催化活性，為木質(zhì)素的分解利用提供了一種更加高效且經(jīng)濟(jì)的方法。