本發(fā)明涉及不依賴支架材料的一種促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基及三維動態(tài)擴增方法，屬于干細胞三維培養(yǎng)。

背景技術：

1、間充質干細胞（msc，mesenchymal?stem?cells）在細胞、組織修復治療中發(fā)揮著多重作用，且具有良好的可獲取性和通用性，被認為是重要的臨床細胞治療藥物。但常規(guī)間充質干細胞在平面二維體系擴增過程中通常伴隨著功能下降、細胞易老化等問題，已有研究報道，間充質體外擴增環(huán)境更接近生理條件時（如缺氧、三維環(huán)境和動態(tài)培養(yǎng)）可優(yōu)化其治療效果。當培養(yǎng)為三維細胞聚集體（3d?aggregates）時，msc在移植后表現(xiàn)出血管生成、抗炎和免疫調節(jié)作用增強，干性和存活率提高等特點，并且在動態(tài)條件下培養(yǎng)可增加其生存能力、增殖和旁分泌作用。

2、如何高效形成間充質干細胞聚集體是目前msc?3d動態(tài)培養(yǎng)的重要問題。采用懸滴法將多個間充質干細胞單細胞成球的方式費力耗時，單細胞聚集成團效率不佳；而低吸附u型孔離心法同樣面臨聚集效率不高的問題?，F(xiàn)今msc規(guī)模化制備一般選用支架材料，如3d微載體，msc貼附到載體材料，實現(xiàn)動態(tài)系統(tǒng)msc擴增，取得了一定成果。但為避免微載體進入人體引起不良反應，在臨床應用中需要使用不含微載體的高純度msc產品。若不使用微載體，僅依靠細胞自主聚集，當聚集體較為松散時，后續(xù)進行動態(tài)懸浮培養(yǎng)擴增難度較大，特別是旋轉搖瓶中的攪拌式動態(tài)培養(yǎng)，松散細胞聚集體無法承受剪切力，無法有效維持3d細胞團形態(tài)。因此，開發(fā)出不依賴微載體等支架材料，提升細胞聚集能力，高效形成相對較為致密3d聚集體，并與軌道搖床或旋轉搖瓶動態(tài)懸浮培養(yǎng)體系兼容，實現(xiàn)msc動態(tài)體系3d擴增是本領域技術人員急需解決的技術問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對犬間充質干細胞僅僅依靠自主聚集無法有效形成3d聚集體，培養(yǎng)難度大，需要加入微載體等支架材料的問題，提供一種促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基及三維動態(tài)擴增方法。

2、本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：

3、本發(fā)明的目的之一在于提供一種促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基，包括2d培養(yǎng)基、聚乙烯醇和rock抑制劑y27632，其中，聚乙烯醇的質量濃度為0.01%-0.05%，y27632的濃度為10μm。

4、進一步，所述聚乙烯醇的分子量為30000-70000。

5、進一步，所述2d培養(yǎng)基的組成為基礎培養(yǎng)基+10%?fbs+5?ng/ml?bfgf。

6、進一步，所述基礎培養(yǎng)基為低糖dmem培養(yǎng)基、dmem高糖培養(yǎng)基、alpha-mem培養(yǎng)基、f12培養(yǎng)基、dmem/f12培養(yǎng)基、rpmi1640培養(yǎng)基或者imdm培養(yǎng)基中的任意一種。

7、本發(fā)明一種促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基的有益效果是：

8、本發(fā)明的培養(yǎng)基在間充質干細胞3d聚集體形成階段用到的核心添加物為聚乙烯醇（pva）和rock抑制劑y27632，添加y27632的主要作用是抑制單細胞凋亡，添加pva模擬細胞外基質成分，pva材料具有與細胞黏附的特征，將合適濃度的pva加入細胞懸液中可以促進多個細胞之間的連接，使細胞進一步聚集；本發(fā)明采用聚乙烯醇的質量濃度為0.01%-0.05%，若pva濃度過高，會導致培養(yǎng)基黏稠度和滲透壓升高，不利于細胞團存活，若pva濃度過低，會導致細胞聚集效果變差，在本發(fā)明限定的聚乙烯醇的質量濃度范圍內，能夠促使犬間充質干細胞高效成球，且不損傷細胞活性。

9、本發(fā)明的目的之二在于提供一種犬間充質干細胞三維動態(tài)擴增方法，其采用如上所述的促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基進行擴增，實現(xiàn)犬間充質干細胞3d細胞聚集體的高效制備。

10、進一步，犬間充質干細胞三維聚集體形成在aggrewell孔板內完成。

11、msc單細胞聚集成球后，3d?msc細胞團將繼續(xù)在動態(tài)懸浮培養(yǎng)體系（如軌道搖床低吸附板或者旋轉搖瓶反應器）中進行擴增。

12、進一步，所述的犬間充質干細胞三維動態(tài)擴增方法具體包括如下步驟：

13、（1）促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基的配制及aggrewell孔板預處理：

14、促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基的配制：在2d培養(yǎng)基中同時加入聚乙烯醇和rock抑制劑y27632，其中，2d培養(yǎng)基的組成為基礎培養(yǎng)基+10%?fbs+5?ng/mlbfgf，所述基礎培養(yǎng)基為低糖dmem培養(yǎng)基、dmem高糖培養(yǎng)基、alpha-mem培養(yǎng)基、f12培養(yǎng)基、dmem/f12培養(yǎng)基、rpmi1640培養(yǎng)基或者imdm培養(yǎng)基中的任意一種；

15、aggrewell孔板預處理：將抗吸附潤洗液加入aggrewell中，離心以去除微孔中的氣泡；

16、（2）單細胞消化：取融合度達85%的犬間充質干細胞，進行傳代，dmem/f12培養(yǎng)基洗滌一次，加入accutase消化4～5分鐘，使用2d培養(yǎng)基進行終止；

17、（3）上述步驟（2）的細胞離心后，采用上述步驟（1）配置的促進犬間充質干細胞三維聚集體形成的培養(yǎng)基重懸細胞，細胞進行計數；

18、（4）將細胞加入aggrewell孔板中，巴氏吸管吹打每孔混勻，立即進行離心；

19、（5）上述步驟（4）離心完成后，放入細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件：37℃，5%?co2；40-50小時后觀察細胞成球情況；

20、（6）3d細胞聚集體形成后，轉移細胞團至軌道搖床的孔板，軌道搖床轉速為90-110rpm，培養(yǎng)條件：37℃，5%?co2；

21、（7）培養(yǎng)4-7天，觀察細胞團粒徑變化，每兩天進行msc細胞換液，細胞粒徑達到300μm，則使用accutase將細胞團消化為單細胞，重復上述步驟（3）-（6），接種至新aggrewell孔板成球后，在軌道搖床體系孔板中擴大培養(yǎng)，若細胞量足夠時，將3d細胞團轉移至旋轉搖瓶中培養(yǎng)；

22、（8）旋轉搖瓶懸浮培養(yǎng)：aggrewell中3d細胞聚集體成球后，轉移細胞團至500ml旋轉搖瓶，轉速65-75rpm，培養(yǎng)條件：37℃，5%?co2，每四天傳一代，使用accutase將細胞團消化為單細胞，同上操作進行傳代懸浮培養(yǎng)。

23、進一步，步驟（2）中，在犬間充質干細胞單細胞消化之前，先進行2d培養(yǎng)。

24、進一步，步驟（2）中的2d培養(yǎng)具體包括：

25、①2d培養(yǎng)基配制：基礎培養(yǎng)基+10%?fbs+5?ng/ml?bfgf；其中，基礎培養(yǎng)基為低糖dmem培養(yǎng)基；

26、②細胞解凍：取出凍存的犬間充質干細胞，37±2℃水浴融化；

27、③細胞離心：移取上述步驟①的2d培養(yǎng)基至離心管中，加入解凍后的細胞懸液，進行離心，棄上清液，保留細胞沉淀；

28、④重懸計數：向離心管中加入上述步驟①的2d培養(yǎng)基，重懸細胞沉淀；用移液管吹吸細胞懸液，使其充分混勻，進行細胞計數及活率檢測；

29、⑤細胞接種：將細胞懸液接種至t75培養(yǎng)瓶中，補加上述步驟①的2d培養(yǎng)基至總體積為15ml，將培養(yǎng)瓶置于co2培養(yǎng)箱中；

30、⑥細胞2d培養(yǎng)換液：細胞每日進行換液，補加上述步驟①的新鮮2d培養(yǎng)基15ml，待細胞增殖至85%匯合度。

31、進一步，步驟（4）中，所述aggrewell孔板為24孔，每孔加入1.5x106個單細胞。

32、本發(fā)明一種犬間充質干細胞三維動態(tài)擴增方法的有益效果在于：使用聚乙烯醇（pva）和rock抑制劑y27632（y），借助aggrewell孔板離心，從而提升msc單細胞形成3d聚集體或3d球體的效果，成功完成動態(tài)體系擴增；首次驗證了msc?3d聚集體培養(yǎng)后細胞特征和功能優(yōu)于2d?msc，且經動物實驗驗證了3d?msc細胞促進糖尿病難愈性傷口愈合的能力。