一種多酚氧化酶固定化載體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定化酶載體的制備方法，特別涉及一種固定化多酚氧化酶載體的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]多酚氧化酶是一類氧化還原酶，具有羥化酶和氧化酶的雙重性質(zhì)，在有氧條件下能催化單酚類化合物羥基化生成鄰苯二酚，再氧化鄰苯二酚脫氫生成醌，這一特性使得多酚氧化酶在工業(yè)、食品和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。游離多酚氧化酶在使用過程中存在穩(wěn)定性低、無法重復(fù)使用、易受環(huán)境條件的影響而使酶活受到抑制等缺陷，阻礙了其推廣應(yīng)用。
[0003]酶的固定化技術(shù)可以使酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，還呈現(xiàn)操作、儲(chǔ)存穩(wěn)定性高，可多次重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，不僅降低了使用成本，還避免了酶蛋白質(zhì)的污染問題，簡(jiǎn)化了后處理過程。固定化載體是固定化酶技術(shù)中的一個(gè)重要部分。載體直接影響酶的固定化效率、固定化酶活性及固定化酶的穩(wěn)定性等重要性質(zhì)。
[0004]殼聚糖是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，分子鏈上分布著大量的羥基和氨基。一方面，其分子鏈上豐富的氨基與各種蛋白質(zhì)的親和力非常高；另一方面，殼聚糖不存在易使酶失活的單體。因此，殼聚糖被廣泛地用作酶的固定化載體。除此之外，多酚氧化酶大部分處于非活性的中間態(tài)，多羥基和多氨基的殼聚糖可以和多酚氧化酶上的羥基和氨基形成氫鍵，使其中間態(tài)變?yōu)榛钚赃€原態(tài)，不僅在多酚氧化酶的固定化過程中避免了酶活的損失，而且還能夠矯正酶的空間構(gòu)型，使酶的活性中心外露，從而提高酶的活性。
[0005]納米金具有良好生物相容性及表面吸附能力，固定到納米金上的酶分子與自由酶相比，呈現(xiàn)出更高的生物活性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。且有研宄表明，納米金粒子對(duì)兒茶酚和對(duì)苯二酚等簡(jiǎn)單酚有明顯的催化氧化作用。但對(duì)納米金粒子的深入研宄發(fā)現(xiàn)，直接在納米金粒子表面進(jìn)行酶組裝，會(huì)不同程度地導(dǎo)致酶活性的降低。殼聚糖因其多羥基和多氨基的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以作為穩(wěn)定劑和還原劑一步合成殼聚糖-納米金粒子。因此，殼聚糖-納米金粒子兼具了殼聚糖和納米金粒子的優(yōu)勢(shì)，是性能更優(yōu)的酶固定化載體。但是，殼聚糖-納米金粒子分離困難，不利于固定化酶的重復(fù)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種固定化效率高、穩(wěn)定性好的多酚氧化酶固定化載體的制備方法。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種在上述載體上固定多酚氧化酶的方法。
[0008]本發(fā)明采用溶液插層法制備多酚氧化酶固定化載體，將殼聚糖分子鏈插入蒙脫土片層間，制備殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物，再利用殼聚糖多羥基和多氨基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其作為穩(wěn)定劑和還原劑還原氯金酸，實(shí)現(xiàn)納米金粒子的一步、原位、綠色合成，制備殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物，并以此插層復(fù)合物為載體固定多酚氧化酶。
[0009]天然蒙脫土是一種2:1型含水層狀硅酸鹽，具有獨(dú)特的層狀結(jié)構(gòu)。特殊的片層結(jié)構(gòu)賦予了蒙脫土良好的離子交換性、膨脹性及吸附性等。天然蒙脫土晶格中的Si4+和Al 3+被低價(jià)陽離子取代后，片層間存在過剩負(fù)電荷，對(duì)陽離子具有良好的吸附性，可以與蛋白質(zhì)的一 NH3+結(jié)合。除此之外，蒙脫土層間具有可設(shè)計(jì)的反應(yīng)性，因而可以將聚合物插入其片層間，使其比表面積增加、層間距增大，降低表面能，并能與聚合物協(xié)同增效，產(chǎn)生更優(yōu)異的性會(huì)K。
[0010]本發(fā)明的殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物的具體制備步驟如下:
(I)殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物的制備:殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物是利用溶液插層法將殼聚糖分子鏈插入蒙脫土片層間制備的；將蒙脫土分散于蒸餾水中，制成I?4%(w/v)的懸濁液，20?60°C攪拌2?8 h，使其充分溶脹；將殼聚糖溶于0.5?3%(v/v)醋酸溶液中，充分溶解后用10?20%(w/v)Na0H溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5?5.3 ;將與蒙脫土物質(zhì)的量比為1:1?1:5殼聚糖溶液緩慢加入充分溶脹的蒙脫土懸浮液中，40?60°C下攪拌反應(yīng)6?12 h ;反應(yīng)結(jié)束后，離心、洗滌、干燥，獲得殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物。
[0011](2)殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物的制備:將氯金酸溶于蒸餾水中，制備濃度為0.01?0.10 mM的氯金酸溶液，用I M HCl或I M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至3.0?9.0 ;將殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸與殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物的質(zhì)量比為0.15%?1.50%(w/w)，40?80°C恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)I?4 h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，產(chǎn)物用蒸餾水洗滌至上清液PH值為中性，即得用于多酚氧化酶固定化載體的殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物。
[0012]所述殼聚糖的分子量為10萬?35萬，脫乙酰度為75?95%。
[0013]所述蒙脫土為Na基蒙脫土。
[0014]本發(fā)明還提供了以殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物為載體固定化多酚氧化酶的方法:將殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物加入pH 5.0?7.0的多酚氧化酶磷酸鹽緩沖溶液中，使得多酚氧化酶與殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物載體質(zhì)量比為20?80mg/g;20?30°C下振蕩吸附4?6 h，過濾除去酶溶液，用pH 6.0?7.0，濃度為0.05?
0.50 M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌固定化酶，直至洗滌液在280 nm處無吸收，即得固定化多酚氧化酶。
[0015]酶活性測(cè)定:以每分鐘催化氧化4.4 /feol/L的左旋多巴(L-DOPA)所需酶量為一個(gè)酶活單位(U);固定化酶活用每克單位載體具有的酶活單位(u/g)表示。
[0016]固定化多酚氧化酶重復(fù)使用的方法:將使用過的固定化多酚氧化酶用pH 6.0?7.0，濃度為0.05?0.50 M的磷酸鹽緩沖溶液充分洗滌，可除去固定化酶上附著的反應(yīng)產(chǎn)物，固定化酶可重復(fù)使用。
[0017]本發(fā)明提供的固定化多酚氧化酶是以殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物為載體制備的。殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物的制備方法簡(jiǎn)單，復(fù)合物耦合了殼聚糖、納米金及蒙脫土的優(yōu)勢(shì)，以此為載體制備的固定化多酚氧化酶具有固定化效率高、酶活性高及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0018]圖1為殼聚糖(a)、殼聚糖/蒙脫土(b)和殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物(C)的紅外光譜圖。
[0019]圖2為殼聚糖(a)、蒙脫土(b)、殼聚糖/蒙脫土(C)和殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物(d)的X-射線衍射圖。
[0020]圖3為殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物的掃描電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1:
將4.0 g Na基蒙脫土加入100 mL蒸餾水中，室溫?cái)嚢? h，使其充分溶脹。將3.3 g殼聚糖溶于250 mL 1%(ν/ν)醋酸溶液中，充分溶解后用20% (w/v) NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4.9。將此殼聚糖溶液緩慢加入上述蒙脫土懸浮液中，加熱至60°C，攪拌反應(yīng)6 ho反應(yīng)結(jié)束后，離心、洗滌、干燥，獲得殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物。
[0023]將氯金酸溶于蒸餾水中，制備濃度為0.01 mM的氯金酸溶液，用I M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.00將殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物加入上述氯金酸溶液中，使得氯金酸與殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物的質(zhì)量比為0.15% (w/wh8(TC恒溫磁力充分?jǐn)嚢鐸 h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，產(chǎn)物用蒸餾水洗滌至上清液PH值為中性，即得殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物。
[0024]如圖1所不，殼聚糖(a)在1655cm 1和1597cm 1處的吸收峰分別為殼聚糖酰胺I帶和一順2的N — H變形振動(dòng)，1420 CnT1和1383 cnT1處的吸收峰分別歸屬為一CH3和一CH2的C 一 H變形振動(dòng)。殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物(b)中3614cm—1處的吸收峰為蒙脫土 Al —O-H的伸縮振動(dòng)，3423cm—1的吸收峰為一 OH和殼聚糖中N — H伸縮振動(dòng)的疊加。1635cm—1處的吸收峰為殼聚糖酰胺I帶和蒙脫土中一 OH彎曲振動(dòng)的疊加吸收峰。殼聚糖在1597CHT1處一順2中N — H變形振動(dòng)的吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)，表明殼聚糖的一 NH3+與蒙脫土片層間負(fù)電荷間發(fā)生了靜電作用。與殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物相比，殼聚糖-納米金/蒙脫土(c)插層復(fù)合物在3626 cnT1處的一 OH伸縮振動(dòng)吸收峰增強(qiáng)，在16520^1處出現(xiàn)了 C=O的吸收峰，這可能是由于殼聚糖/蒙脫土中的一 OH參與了 HAuCl4的還原反應(yīng)，HAuCl 4將殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物(b)中的一OH氧化成了 C=0。3347cm—1和1543 cm ―1處N — H的伸縮振動(dòng)和變形振動(dòng)吸收峰表明殼聚糖的N — H參與了撤11(:14的還原和穩(wěn)定，形成了 Au -N。
[0025]如圖2所示，殼聚糖(a) 2 0= 12.9 °和19.9 °處有兩個(gè)特征峰，呈現(xiàn)“L-2polymorph”晶形衍射圖。蒙脫土(b)的特征衍射峰出