一種固定化酶載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于固相化酶材料制備及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化酶載體及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶的固定化是指通過物理、化學(xué)方法，利用載體將酶限制或束縛在一定的區(qū)域內(nèi) 進(jìn)行催化反應(yīng)的一種酶工程技術(shù)。固定化酶在一定程度上保持了酶特有的催化活性，同時 克服了酶不穩(wěn)定、易失活和難以分離提純等不足，從而降低生產(chǎn)成本，是近年來酶工程領(lǐng)域 最為活躍的研宄重點(diǎn)之一，在工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有極為廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 目前酶的固定化，主要采用離子交換作用力、物理吸附力、包埋法或共價結(jié)合法。 離子交換作用力，結(jié)合的酶過少；包埋法，酶易漏失，常存在擴(kuò)散限制等問題，催化反應(yīng)受傳 質(zhì)阻力的影響；共價結(jié)合法，反應(yīng)條件劇烈，會引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)的變化，破壞部分活性 中心，因此往往得不到活力高的固定化酶。
[0004] 碳納米管是一種新型的納米材料，憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的機(jī)械、電學(xué)、光學(xué)、 熱力學(xué)、形態(tài)學(xué)特性及良好的生物相容性而備受人們的關(guān)注，在納米電子學(xué)、納米生物技 術(shù)、生物傳感器、生物大分子載體、生物醫(yī)學(xué)器件、藥物運(yùn)載系統(tǒng)等方面更是受到了廣大研 宄人員的青睞。與其他大體積的固體材料相比，碳納米管特殊的中空管狀結(jié)構(gòu)具有較大的 比表面積，且憑借其強(qiáng)吸附能力和高機(jī)械穩(wěn)定性而成為一種理想的固定化酶材料。
[0005] 碳納米管可以通過非特異性吸附等方式吸附許多蛋白，碳納米管的頂端可被氧化 打開，小的蛋白質(zhì)分子就可以進(jìn)入管道中，用這種方式可以使固定在碳納米管上的酶保持 正常的生物活性。但是，由于碳納米管顆粒尺寸過小，通過抽濾等方式分離困難，耗能過大 且損失較多，不利于固定化酶的回收利用。磁性納米顆粒為具有納米級粒徑的磁性顆粒，具 有超順磁性及大比表面積，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、材料學(xué)領(lǐng)域。但是磁性納米顆粒表面功能基團(tuán) 種類有限，傳統(tǒng)多利用共價鍵或離子交換作用力結(jié)合酶分子，往往導(dǎo)致酶的分子結(jié)構(gòu)形變， 降低表觀酶活力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明的目的是提供了 一種固定化酶載體，利用親水性溶膠-凝膠型化合物將碳納米管枝接在磁性納米顆粒表 面，通過非特異性吸附作用力將如碳酸酐酶的生物酶與固定化酶載體表面的碳納米管結(jié) 合，形成固定化的生物酶，利用磁性納米顆粒的超順磁性實現(xiàn)固定化酶的分離，由此解決目 前碳納米管顆粒固定化酶難以回收的技術(shù)問題。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述固定化 酶載體的制備方法。本發(fā)明還有一目的是提供一種上述固定化酶載體的應(yīng)用。
[0007] 技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] 一種固定化酶載體，包括磁性納米顆粒、親水性溶膠-凝膠型化合物以及碳納米 管，親水性溶膠-凝膠型化合物包裹在磁性納米顆粒表面形成富羥基殼，富羥基殼包裹碳 納米管的一端，將碳納米管枝接在磁性納米顆粒表面。
[0009] 所述磁性納米顆粒為納米鐵氧化物、納米鈦氧化物或納米硅氧化物；磁性納米顆 粒粒徑為50?200nm。
[0010] 所述親水性溶膠-凝膠型化合物為高熔點(diǎn)瓊脂糖或殼聚糖，其溶膠溫度為40? 80。。。
[0011] 所述碳納米管為多壁碳納米管或單壁碳納米管，其長度為50?500nm，每克固定 化酶載體枝接有50?500mg碳納米管。
[0012] 所述富羥基殼的平均厚度為20?100nm。
[0013] 一種制備所述固定化酶載體的方法，包括以下步驟：
[0014] 1)制備磁性納米顆粒；
[0015] 2)將親水性溶膠-凝膠型化合物溶于水中，加熱至沸騰形成濃度為10?50g/L溶 膠；將碳納米管加入至沸騰的溶膠中，70?100°C220w超聲分散30min，獲得富含碳納米管 的親水性溶膠-凝膠型化合物溶液；
[0016] 3)將磁性納米顆粒加入到富含碳納米管的親水性溶膠-凝膠型化合物溶液中， 70?100°C220w超聲分散30min，得到磁性Fe304、碳納米管和瓊脂糖的懸濁液；將懸濁液 加入積比為50?100:1的甲苯-三氯甲烷溶液、司班80組成的混合溶液中，65°C，1000r/ min，強(qiáng)力攪拌20?30min，得到均勾體系；
[0017] 4)對均勻體系持續(xù)攪拌，自然冷卻后，用乙醚和雙蒸水清洗；磁性分離得到枝接 有碳納米管的磁性納米顆粒；將碳納米管枝接磁性納米顆粒低溫旋轉(zhuǎn)蒸干，研磨后篩選粒 徑200目以下顆粒，即制得固定化酶載體。
[0018] 步驟2)中，所述的碳納米管在溶膠凝膠型化合物溶液中的質(zhì)量濃度為10?100g/ L〇
[0019] 步驟3)中，所述的磁性納米顆粒在富含碳納米管的親水性溶膠-凝膠化合物溶液 中的質(zhì)量濃度為5?50g/L。
[0020] 所述固定化酶載體在制備固定化酶中的應(yīng)用。所述的酶包括碳酸酐酶、木聚糖酶 和葡萄糖苷酶。
[0021] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用親水性溶膠-凝膠型化合物，將碳納米管 枝接在磁性納米顆粒表面，能夠取得以下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] (1)該固定化酶載體，制備工藝簡單，重復(fù)操作穩(wěn)定性好，適用于大規(guī)模工業(yè)化制 備，采用碳納米管與磁性納米顆粒結(jié)合，通過磁性分離回收生物酶，克服了碳納米管作為固 定化酶載體難以回收的困難，大幅度降低固定化酶連續(xù)運(yùn)作回收利用的成本。
[0023] (2)該固定化酶載體，通過非特異性吸附作用與待固定化酶結(jié)合，能夠?qū)⑸锩咐?固的固定在載體表面，生物酶不易從固定化載體表面脫落，催化效果穩(wěn)定持久。
[0024] (3)該固定化酶載體，通過非特異性吸附作用與待固定化酶結(jié)合，可結(jié)合不同的 酶，非特異性的結(jié)合方式使得本載體的適用酶的范圍較廣。
[0025] (4)該固定化酶載體，具有較大比表面積，與生物酶結(jié)合效率高。
[0026] (5)該固定化酶載體，具有納米級粒徑，使得固定化酶在催化體系中的分散性優(yōu)于 微米級以上的固定化酶，從而減小固定化酶在催化體系中的傳質(zhì)阻力，最大限度地保證固 定化酶的催化效率。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明提供的固定化酶載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
【具體實施方式】
[0028] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼 此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0029] 一種固定化酶載體，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，包括磁性納米顆粒1、親水性溶 膠-凝膠化合物2以及碳納米管3。磁性納米顆粒，平均粒徑在50?200nm之間，可為納 米鐵氧化物或納米鈦氧化物，例如：Fe304、Fe203、Ti02，優(yōu)選磁性和穩(wěn)定性良好且成本較低的 ?630 4;碳納米管，為單壁碳納米管或多壁碳納米管，長度為50?500nm;親水性溶膠-凝膠 化合物，為高膠熔點(diǎn)瓊脂糖或殼聚糖，磁性納米顆粒包裹在親水性溶膠-凝膠化合物內(nèi)，親 水性溶膠-凝膠化合物包裹碳納米管的一端，將碳納米管枝接在磁性納米顆粒表面，碳納 米管與待固定化的酶通過非特異性吸附結(jié)合。
[0030] 下面僅以磁性和穩(wěn)定性良好且成本較低的Fe304為例，按照優(yōu)選方案說明。
[0031] 實施例1
[0032] 一種固定化酶載體的制備方法，包括以下步驟：
[0033] (1)制備磁性納米顆粒：采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe304納米顆粒，控制平均粒 徑為50nm。
[0034] (2)制備富含碳納米管的親水性溶膠-凝膠型化合物：將1. 0g瓊脂糖溶于45mL水 中，加熱至沸騰形成溶膠。將〇.5g碳納米管（長度為50nm)加入至沸騰的瓊脂糖溶液中， 80°C220w超聲分散30min，獲得富含碳納米管的親水性溶膠-凝膠型化合物溶液。
[0035] (3)對步驟⑴中制備的磁性納米顆粒進(jìn)行碳納米管枝接修飾：將0.5g