新型植物表達(dá)構(gòu)建物的制作方法
【專利說明】新型植物表達(dá)構(gòu)建物
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2000年12月12日，申請(qǐng)?zhí)枮?00810212531. 1，發(fā)明名稱為"新 型植物表達(dá)構(gòu)建物"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用核酸分子以控制植物中的基因表達(dá)，所述核酸分子具體是 新型植物啟動(dòng)子。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 植物遺傳工程的一個(gè)目標(biāo)是產(chǎn)生具有重要農(nóng)學(xué)特征或性狀的植物。遺傳工程 的最近發(fā)展已經(jīng)提供了產(chǎn)生包含和表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物的必要工具（Kahl等， WorldJ.ofMicrobiol.Biotech. 11:449-460,1995)。對(duì)于植物遺傳工程尤其需要的目 的性狀或品質(zhì)包括但不限于：昆蟲抗性、真菌病抗性、對(duì)其它害蟲和病原體的抗性、除草 劑耐性、更高的穩(wěn)定性或更長的保存期、更高產(chǎn)量、環(huán)境耐性以及營養(yǎng)強(qiáng)化（nutritional enhancement)。植物轉(zhuǎn)化和再生領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)使得研究者能夠從異源來源或天然 來源提取外源DNA(如一個(gè)基因或多個(gè)基因），然后將所述外源DNA摻入植物基因組。在一 種方法中，通常不在特定植物或特定植物組織中表達(dá)的新型基因的表達(dá)可能賦予所需的表 型效應(yīng)。在另一種方法中，以反義取向的基因或基因部分的轉(zhuǎn)錄可能通過防止或抑制內(nèi)源 基因的表達(dá)而產(chǎn)生所需效應(yīng)。
[0005] 為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，將包括異源基因序列的構(gòu)建物引入植物細(xì)胞，所述異源基因 序列當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)賦予所需表型。所述構(gòu)建物還包括有效連接所述異源基因序列的植 物啟動(dòng)子，該植物啟動(dòng)子通常在一般情況下不與所述異源基因連接。將所述構(gòu)建物引入植 物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，然后將所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。所述啟動(dòng)子控制 該啟動(dòng)子有效連接的所引入DNA序列的表達(dá)，并因此影響所述DNA序列所賦予的所需特性。
[0006] 利用多種啟動(dòng)子定制基因表達(dá)可能是有利的，以便一個(gè)基因或多個(gè)基因在植物生 長和發(fā)育的恰當(dāng)時(shí)間、在所述植物中的最佳位點(diǎn)并且以產(chǎn)生所需效應(yīng)所必需的量有效轉(zhuǎn) 錄。例如，基因產(chǎn)物的組成型表達(dá)在植物的一個(gè)位點(diǎn)可能是有利的，但在該植物的另一部分 就不是那么有利。在其它情況下，在植物某個(gè)發(fā)育階段或在應(yīng)答某些環(huán)境或化學(xué)刺激時(shí)產(chǎn) 生基因產(chǎn)物可能是有利的。遺傳改良種質(zhì)的商業(yè)化發(fā)展也已經(jīng)前進(jìn)到將多種性狀引入作物 的階段，該方法常常被稱為基因堆積方法（genestackingapproach)。在該方法中，可以將 賦予不同目的性狀的多種基因引入植物。當(dāng)將多種基因引入植物時(shí)，重要的是調(diào)整或控制 每個(gè)基因以獲得最佳表達(dá)，并且使得調(diào)節(jié)元件多樣化，以降低基因沉默的可能性。根據(jù)這些 和其它的考慮，在植物生物工程技術(shù)中基因表達(dá)的最佳控制和調(diào)節(jié)元件多樣化顯然是重要 的。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明涉及包含以下元件的DNA植物表達(dá)構(gòu)建物：擬南芥屬肌動(dòng)蛋白（Act)啟動(dòng) 子序列Actla、Actlb、Act2、Act3、Act7、Act8、Actll、Actl2 和延伸因子 1a(EF1a)啟動(dòng) 子序列、以及由有效連接于在作物細(xì)胞中起作用的異源結(jié)構(gòu)基因序列的這些啟動(dòng)子獲得的 片段和順式元件。
[0009] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供以有效連接包含下列元件的重組DNA構(gòu) 建物：在作物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包括：來自SEQIDNO:9、SEQIDN0 :10、 SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDNO: 25和SEQIDNO:26的至少一種順式元件；對(duì)于所述啟動(dòng)子異源的結(jié)構(gòu)DNA序列；和在植物 中起作用的3'非翻譯區(qū)，該3'非翻譯區(qū)引起在RNA序列的3'末端添加聚腺苷酸化核苷酸。 例如，所述啟動(dòng)子可以主要包含來自下面任何一種的5'調(diào)節(jié)區(qū)：SEQIDNO:9、SEQIDN0 : 10、SEQIDNO:11、SEQIDNO: 12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQID NO:25和SEQIDNO:26(包括或不包括它們中間的任何內(nèi)含子序列）。所述結(jié)構(gòu)基因可以 包含任何異源核苷酸序列，其中所述序列的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物中在農(nóng)學(xué)上有用的性狀或 產(chǎn)品。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一方面是一種DNA構(gòu)建物，該DNA構(gòu)建物包含有效連接本發(fā)明啟動(dòng) 子序列的結(jié)構(gòu)DNA序列，所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼賦予作物除草劑耐性的蛋白。該除草劑耐 性蛋白包括但不限于草甘膦耐性蛋白基因如單獨(dú)的草甘膦抗性EPSP合酶基因，或者該基 因與一種或多種草甘膦降解蛋白基因的組合。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供如上文所述的那些DNA構(gòu)建物，其中所述啟動(dòng) 子是雜種或嵌合啟動(dòng)子，包含有效連接異源啟動(dòng)子序列的由選自以下的一種或多種序列獲 得的至少一種順式元件：SEQIDN0 :9、SEQIDN0 :10、SEQIDN0 :11、SEQIDN0 :12、SEQ IDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25和SEQIDN0:26,所述異源啟動(dòng)子 序列如花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子或玄參花葉病毒啟動(dòng)子。
[0012].根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方案，提供串聯(lián)的例如如上文所述的DNA構(gòu)建物，其中所 述啟動(dòng)子是雜種或嵌合啟動(dòng)子，包含有效連接在轉(zhuǎn)基因作物細(xì)胞中表達(dá)的異源基因序列的 由選自以下的一種或多種序列獲得的至少一種順式元件：SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQ IDNO: 11、SEQIDNO: 12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和 SEQIDN0:26。所述嵌合啟動(dòng)子序列更具體地是包含在SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQ IDNO: 29和SEQIDNO:30中定義的序列。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方案，提供例如如上文所述的DNA構(gòu)建物，其中所述結(jié)構(gòu) DNA序列是草甘膦耐性基因，使得當(dāng)將所述DNA構(gòu)建物引入植物細(xì)胞時(shí)，它賦予所述植物 細(xì)胞對(duì)于每升至少包括50克酸當(dāng)量（ga.e./l)草甘膦的草甘膦水溶液制劑的耐性。在 其它相關(guān)實(shí)施方案中，所述DNA構(gòu)建物賦予所述植物細(xì)胞對(duì)于草甘膦濃度更高（例如每升 至少300克酸相當(dāng)草甘膦）的草甘膦制劑的耐性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建物 賦予所述植物細(xì)胞對(duì)于以下除草劑施用的耐性：例如以每英畝16盎司（oz)的比率施用 RoundupUltra?.至少一次，而在其它實(shí)施方案中，草甘膦耐性擴(kuò)展到例如以每畝16oz、每 英畝32oz或每英畝64oz施用一到二次或更多次。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供用上文所述DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物，其 中包括單子葉植物物種和雙子葉植物物種。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)使用擬南芥屬肌動(dòng)蛋白和擬 南芥屬EF1a啟動(dòng)子在其它作物物種例如棉花、番茄和向日葵中控制草甘膦耐性基因（如 aroA:CP4)表達(dá)時(shí)，所述啟動(dòng)子充分有活性，所述植物耐受草甘膦的商業(yè)化施用比率，展現(xiàn) 良好的營養(yǎng)性耐性以及對(duì)繁殖組織的損傷低。也可以使用這樣的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)其它 目的基因，所述目的基因包括但不限于賦予下列性狀的基因：除草劑耐性、昆蟲防制、抗病 性、穩(wěn)定性增加或保存期增加、產(chǎn)量提高、營養(yǎng)強(qiáng)化、表達(dá)藥用多肽產(chǎn)物或其它需要的多肽 產(chǎn)物、或植物生理學(xué)或形態(tài)學(xué)的所需改變等等。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供用多種DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述DNA 構(gòu)建物包含擬南芥屬肌動(dòng)蛋白和擬南芥屬EF1a啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子在其它作物物種例如 棉花、番茄和向日葵中控制草甘膦耐性基因（如aroA:CP4)表達(dá)時(shí)充分有活性，所述植物耐 受草甘膦的商業(yè)化施用比率，展現(xiàn)良好的營養(yǎng)性耐性以及對(duì)繁殖組織的損傷低。也可以使 用這樣的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)其它目的基因，所述目的基因包括但不限于賦予下列性狀的 基因：除草劑耐性、昆蟲防制、抗病性、穩(wěn)定性增加或保存期增加、產(chǎn)量提高、營養(yǎng)強(qiáng)化、表達(dá) 藥用多肽產(chǎn)物或其它需要的多肽產(chǎn)物、或植物生理學(xué)或形態(tài)學(xué)的所需改變等等。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方案，提供用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物，所述DNA構(gòu)建 物包含擬南芥屬肌動(dòng)蛋白和擬南芥屬EF1a啟動(dòng)子作為與花椰菜花葉病毒DNA分子融合的 嵌合DNA分子，所述嵌合DNA分子在植物中具有啟動(dòng)子活性，在其它作物物種例如棉花、番 茄和向日葵中充分有活性，例如當(dāng)用來控制草甘膦耐性基因（如aroA:CP4)表達(dá)時(shí)，所述植 物耐受草甘膦的商業(yè)化施用比率，展現(xiàn)良好的營養(yǎng)體耐性以及對(duì)生殖組織的損傷低。也可 以使用這樣的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)其它目的基因，所述目的基因包括但不限于賦予下列性 狀的基因：除草劑耐性、昆蟲防制、抗病性、穩(wěn)定性增加或保存期增加、產(chǎn)量提高、營養(yǎng)強(qiáng)化、 表達(dá)藥用多肽產(chǎn)物或其它需要的多肽產(chǎn)物、或植物生理學(xué)或形態(tài)學(xué)的所需改變等等。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方案，提供在植物中表達(dá)結(jié)構(gòu)DNA序列的方法。這樣的方 法包括：提供如上文所述的DNA構(gòu)建物，將所述DNA構(gòu)建物引入植物細(xì)胞，然后再生所述植 物細(xì)胞產(chǎn)生植株，以便在所述植物中可表達(dá)所述結(jié)構(gòu)DNA。根據(jù)一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案，提供防 除雜草的方法，其中所述DNA構(gòu)建物包含草甘膦耐性基因，對(duì)用所述DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的作物 施用一次其用量足以防除雜草而不會(huì)顯著損害所述作物的草甘膦。
[0018] 附圖簡述
[0019] 圖1是pCGN8086的質(zhì)粒圖譜。
[0020] 圖2是pM0N45325的質(zhì)粒圖譜。
[0021] 圖3是pM0N45331的質(zhì)粒圖譜。
[0022] 圖4是pM0N45332的質(zhì)粒圖譜。
[0023] 圖5是pCGN9190的質(zhì)粒圖譜。
[0024] 圖6是pCGN9153的質(zhì)粒圖譜。
[0025] 圖7是pCGN8099的質(zhì)粒圖譜。
[0026] 圖8是pCGN8088的質(zhì)粒圖譜。
[0027] 圖9是pCGN8068的質(zhì)粒圖譜。
[0028] 圖10是pCGN8096的質(zhì)粒圖譜。
[0029] 圖11是PCGN9151的質(zhì)粒圖譜。
[0030] 圖12是pM0N10156的質(zhì)粒圖譜。
[0031] 圖13是pM0N52059的質(zhì)粒圖譜。
[0032] 圖14是pM0N54952的質(zhì)粒圖譜。
[0033] 圖15是pM0N54953的質(zhì)粒圖譜。
[0034] 圖16是pM0N54954的質(zhì)粒圖譜。
[0035] 圖17是pM0N54955的質(zhì)粒圖譜。
[0036] 圖18是pM0N54956的質(zhì)粒圖譜。
[0037] 序列表簡述
[0038]SEQIDN0:1是用于分離Act2啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0039]SEQIDN0 :2是用于分離Act2啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0040]SEQIDN0 :3是用于分離Act8啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0041] SEQIDN0 :4是用于分離Act8啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0042]SEQIDN0 :5是用于分離Actll啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0043]SEQIDN0:6是用于分離Actll啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0044]SEQIDN0 :7是用于分離EF1啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0045]SEQIDN0 :8是用于分離EF1啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0046] SEQIDN0:9是Act2啟動(dòng)子的序列，其中包括Act2基因的內(nèi)含子序列。堿基位 置1-764代表啟動(dòng)子序列；堿基位置765-1215代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的5堿基5' 非翻譯區(qū)（5'UTR);轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置597。
[0047] SEQID勵(lì)：10是八(^8啟動(dòng)子的序列，其中包括4(^8基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基 位置1-797代表啟動(dòng)子序列；堿基位置798-1259代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的10堿基 5'UTR;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置646。
[0048]SEQIDN0 :11是Actll啟動(dòng)子的序列，其中包括Actll基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿 基位置1-1218代表啟動(dòng)子序列；堿基位置1219-1381代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的10 堿基5'UTR;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置1062。
[0049]SEQIDN0:12是EF1啟動(dòng)子的序列，其中包括EFI基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位 置1-536代表啟動(dòng)子序列；堿基位置537-1137代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的22堿基 5'UTR;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置481。
[0050]SEQIDN0:13是用于分離Actla啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0051] SEQIDN0 :14是用于分離Actlb啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0052]SEQIDN0 :15是用于分離Actla和Actlb啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0053]SEQIDN0:16是用于分離Act3啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0054]SEQIDN0:17是用于分離Act3啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0055]SEQIDN0 :18是用于分離Act7啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0056]SEQIDN0:19是用于分離Act7啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0057]SEQIDN0:20是用于分離Actl2啟動(dòng)子的正向PCR引物。
[0058]SEQIDN0:21是用于分離Actl2啟動(dòng)子的反向PCR引物。
[0059] SEQIDN0 :22是Actla啟動(dòng)子的序列，其中包括Actla基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿 基位置1-1033代表啟動(dòng)子序列；堿基位置1034-1578代表內(nèi)含子和5'UTR。
[0060]SEQIDN0 :23是Actlb啟動(dòng)子的序列，其中包括Actlb基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿 基位置1-914代表啟動(dòng)子序列；堿基位置915-1468代表內(nèi)含子和5'UTR序列。
[0061] SEQIDN0:24是Act3啟動(dòng)子的序列，其中包括Act3基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基 位置1-1023代表啟動(dòng)子序列；堿基位置1024-1642代表內(nèi)含子和5'UTR序列。
[0062]SEQIDN0:25是Act7啟動(dòng)子的序列，其中包括Act7基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基 位置1-600代表啟動(dòng)子序列；堿基位置601-1241代表內(nèi)含子和5'UTR序列。
[0063]SEQIDN0:26是Actl2啟動(dòng)子的序列，其中包括Actl2基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿 基位置1-1017代表啟動(dòng)子序列；堿基位置1018-1313代表內(nèi)含子和