抑制cd44基因的寡聚核酸及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體是涉及一類抑制CD44基因的寡聚核酸及其應用。
【背景技術】
[0002] 骨關節(jié)炎（OA)是世界上致殘的重要原因之一，大約多于10%的老年人有骨關節(jié) 炎的癥狀。風濕性關節(jié)炎（RA)是一個慢性炎癥疾病，影響著世界上約0.5%到1 %的成年 人，通常導致關節(jié)損壞并危及生活質量。多種炎性細胞因子如TNF-a . IL-L IL-6等參與了 RA和OA的發(fā)病和進展，其通過激活免疫細胞及誘導金屬蛋白酶產生而促進關節(jié)破壞、滑膜 炎、血管增生等。多種炎性細胞因子如TNF-a . IL-L IL-6等參與了 RA和OA的發(fā)病和進展， 其通過激活免疫細胞及誘導金屬蛋白酶產生而促進關節(jié)破壞、滑膜炎、血管增生等。
[0003] ⑶44分子是廣泛表達于細胞表面的I類跨膜單鏈糖蛋白，其分布包括淋巴細胞、 單核細胞、紅細胞、成纖維細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、神經膠質細胞及腫瘤細胞等。CD44 分子最初作為粘附分子，介導細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的相互作用，隨著研 究發(fā)現，CD44分子也可以參與細胞間的信號傳導，并與腫瘤的生長、侵襲、轉移以及造血干 細胞的歸巢等密切相關；研究表明CD44作為多種腫瘤干細胞的標志物，是潛在的腫瘤治療 靶點，且CD44的生物學功能及其表達調控模式因腫瘤種類以及生長條件的不同而有所不 同.另外，CD44還與炎癥因子的釋放、淋巴細胞的激活、傷口的愈合、自身免疫病等相關。
[0004] 在過去的20多年里，大多數新型治療方法的研發(fā)工作是關于疾病緩解的抗關節(jié) 炎藥物（DMRDs)和疾病緩解的抗風濕性關節(jié)炎的藥物（DMOADs)。到目前為止，制藥業(yè)在研 制有效安全的疾病緩和性藥物（DMOADs)上并不成功，致使成千上萬的病人仍受到該嚴重 致殘性疾病所帶來的痛苦。隨著新途徑和給藥方法的應用，在該治療領域預期將有更多的 發(fā)展，這為可阻斷、逆轉疾病過程并緩和疾病的藥物，如siRNA提供了巨大的發(fā)展空間。
[0005] RNA干預是生命科學上具革命意義的發(fā)現，成為研究基因功能的重要工具，它能夠 導致生物體，哺乳動物細胞，甚至動物中的基因失活。RNA干預技術可應用于治療有關有害 基因過度表達的疾病，具有創(chuàng)造人類疾病治療新方法的潛力。
[0006] 在本發(fā)明中，我們提供一種全新的siRNA作為關節(jié)炎及相關炎癥的治療藥物；一 種通過骨關節(jié)腔局部注射siRNA及其制劑抑制炎癥因子表達，實現了對關節(jié)炎癥的治療作 用。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明目的旨在提供一類抑制⑶44基因表達的寡聚核酸。
[0008] 實現上述目的的技術方案如下。
[0009] -類抑制CD44基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸為雙鏈RNA，所述寡聚核酸的堿基 組成為：
[0010] 包括有⑴含有SEQ. ID NO. 18所示的70%以上同源的反義鏈；（2)含有與⑴所 述反義鏈反向互補配對的寡聚核酸50%以上序列同源的正義鏈；且（3)所述（1)和（2)寡 聚核酸經過退火后能形成雙鏈結構。
[0011] 在其中一個實施例中，所述寡聚核酸包括有（1)由SEQ. ID NO. 18堿基序列所示的 反義鏈；⑵含有SEQ. ID NO. 17所示至少50%序列同源構成的正義鏈；且⑶正義鏈和反 義鏈經過退火后能形成雙鏈結構。
[0012] 在其中一個實施例中，所述寡聚核酸包括有（1)含有SEQ. ID NO. 18所示至少70% 序列同源構成的反義鏈；（2)由SEQ. ID NO. 17堿基序列所示的正義鏈；且（3)正義鏈和反 義鏈經過退火后能形成雙鏈結構。
[0013] 在其中一個實施例中，所述寡聚核酸包括有（1)含有SEQ. ID NO. 18所示至少70% 序列同源構成的反義鏈；（2)含有SEQ. ID NO. 17所示至少70%序列同源構成的正義鏈；且 (3)正義鏈和反義鏈經過退火后能形成雙鏈結構。
[0014] 在其中一個實施例中，所述寡聚核酸由堿基組成如SEQ. ID NO. 18所示的反義鏈以 及堿基組成如SEQ. ID NO. 17所示的正義鏈組成。
[0015] 在其中一個實施例中，所述寡聚核酸由堿基組成如siRNA-⑶-28、siRNA-⑶-36、 siRNA-CD-39、siRNA-CD-40、siRNA-CD-41、siRNA-CD-42 所示。
[0016] 本發(fā)明提供寡聚核酸是雙鏈RNA，其中所述雙鏈RNA中的特征為：反義鏈含有核苷 酸序列為"51衝此(：呢464(^呢(^63'"如序列表中序列18，或與其具有至少70%以上同源 性的同源序列；正義鏈含有與反義鏈反向互補鏈具有50%同源性以上的核苷酸序列。上述 寡聚核酸可經過（1)-(4)中任一種或多種修飾：
[0017] 1)對所述寡聚核酸的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二酯鍵 的氧用硫取代；
[0018] 2)對所述寡聚核酸的所含核糖進行修飾，優(yōu)選將核糖2'_0H用甲氧基或氟取代或 者對所述2' -OH進行脫氧修飾，或以開環(huán)核酸（UNA)進行修飾；
[0019] 3)對所述寡聚核酸的核苷酸堿基的修飾，優(yōu)選胞嘧啶5位甲基修飾、5-乙炔基尿 嘧啶、吲哚修飾；
[0020] 4)對所述寡聚核酸末端修飾，優(yōu)選末端連接膽固醇、多肽、熒光、糖、抗體分子、磷 酸化修飾；
[0021] 5)本發(fā)明所述寡聚核酸在3'末端可以添加懸掛堿基，優(yōu)選懸掛堿基為dTdT。
[0022] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種有抑制⑶44基因表達功能的DNA。
[0023] 具體技術方案如下。
[0024] 可表達上述任一種寡聚核酸且具有抑制⑶44基因表達功能的DNA。
[0025] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種具有抑制⑶44基因表達功能的載體。
[0026] 具體技術方案如下。
[0027] 含有上述任一種寡聚核酸或者上述DNA的載體，所述載體為脂質體、聚合物材料、 多肽、納米材料。其中脂質體載體材料為本領域常用的陽離子脂質體，優(yōu)選lip〇2000 ;聚合 物載體材料優(yōu)選透明質酸或聚賴氨酸；多肽材料優(yōu)選RGD ;納米材料優(yōu)選為殼聚糖納米粒。
[0028] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種具有抑制⑶44基因表達功能的組合物。具體 技術方案如下。
[0029] -種具有抑制⑶44基因表達功能的組合物，含有上述任一種寡聚核酸或者上述 DNA，以及藥學上可接受的載體。
[0030] 本發(fā)明的另一目的還在于提供上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物的應用。
[0031] 具體技術方案如下。
[0032] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物在制備抑制細胞中⑶44基因表達制品中的 應用。
[0033] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物在制備調節(jié)細胞中⑶44基因制品中的應用。
[0034] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物在制備診斷⑶44基因異常引發(fā)的疾?、?4 的試劑中的應用。
[0035] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物制備治療CD44基因異常引發(fā)的疾病的藥物 中的應用。
[0036] 在其中一個實施例中，所述CD44基因異常引發(fā)的疾病可選自炎癥、癌癥。
[0037] 在其中一個實施例中，所述CD44基因異常引發(fā)的疾病為關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎或 滑膜炎。
[0038] 本發(fā)明針對CD44基因 CDs區(qū)域內的不同位置進行優(yōu)化設計，選擇了 9對針對人與 鼠同源基因的siRNA進行篩選試驗。研究結果表明：與陰性對照SiRNA相比，反義鏈含有核 苷酸序列為"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "的siRNA-CD-06對CD44基因 mRNA表達抑制效果 最強，對⑶44基因的mRNA沉默效率達87 % (實施例二）。在免疫印跡（western blotting) 實驗中，與空白和陰性對照組相比加入siRNA-⑶-06后，⑶44蛋白表達水平明顯下降，差異 有顯著性（P〈〇. 05)(實施例三）。經IL l-α刺激后的細胞中加入siRNA-⑶-06,與加入陰 性對照寡聚核酸相比，細胞炎癥因子TNF、COX-2、IL-I β含量明顯下降，表明siRNA-⑶-06 具有消除炎癥效果（實施例四）。在實施例五中，本發(fā)明對序列進行了優(yōu)化，實驗結果表明： 反義鏈含"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'的同源序列的雙鏈寡核酸對CD44基因 mRNA具有抑 制效果；正義鏈與反義鏈反向完全互補或部分僅部分互補對CD44基因 mRNA也具有抑制效 果，且含有與反義鏈70%同源序列的雙鏈RNA也具有抑制效果。實施例六應用質粒載體表 達"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "序列，在細胞中也具有良好的CD44基因的mRNA抑制效果。 實施例七研究了化學修飾對核酸沉默CD44基因效果的影響，結果表明：經適當的修飾后的 寡聚核酸對CD44基因具有良好的抑制作用。實施例八的研究表明，經化學修飾后，本發(fā)明 的siRNA在血清中的穩(wěn)定性顯著提高。實施例九和實施例十為siRNA的活體大鼠試驗，在 關節(jié)炎模型大鼠的關節(jié)腔內單獨或混合注射含反義鏈" 5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "的化學 修飾物，后續(xù)的組織病理切片和關節(jié)液炎癥因子含量檢測試驗表明，寡聚核酸在大鼠體內 有明顯的炎癥抑制作用。
[0039] 本發(fā)明的創(chuàng)新性主要體現在：1、本發(fā)明運用基因沉默技術，經過大量的設計、篩 選、分析與驗證發(fā)現了一類對CD44有顯著抑制作用的寡聚核酸，在一類hFLS細胞中，抑制 效率達到88%，且與該序列具有70%以上同源性的核酸序列都能起到基因沉默的效果，表 明本發(fā)明是一類對C