兩種水稻縱卷葉螟幼蟲的分子生物學區(qū)分方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻生產(chǎn)上兩種水稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis幼蟲的分子生物學區(qū)分方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis 和 Marsamia patnalis 是水稻生產(chǎn)上的兩種重要害蟲，均取食為害水稻葉片并縱向形成卷葉，影響葉片光合作用，造成水稻減產(chǎn)。
[0003]兩種水稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis 和 Marsamia patnalis)的幼蟲形態(tài)和危害方式相似，幼蟲均先在水稻葉尖危害，后往水稻葉片中部危害，吐絲將葉片縱卷，并取食。對水稻造成的危害狀態(tài)也相似，都會形成白葉。根據(jù)田間危害狀況很難判斷是哪種水稻縱卷葉螟。這兩種水稻縱卷葉螟幼蟲均呈黃綠色，兩者的細微差別肉眼很難分辨。再者，當蟲體受到微生物感染，蟲體會完全喪失原有的形態(tài)特征，導致無法判斷是何種水稻縱卷葉螟。
[0004]目前，對于這兩種水稻縱卷葉螟幼蟲的鑒定，通常借助形態(tài)學特征來區(qū)分，因其形態(tài)極為相似而很容易混淆。區(qū)分時還必須保證待測樣本的關(guān)鍵形態(tài)特征保存完整，但當形態(tài)特征喪失或變形后，則無法準確區(qū)分這兩種水稻縱卷葉螟，這極大地限制了兩種水稻縱卷葉螟的相關(guān)研究工作。例如，若要研究某地使用微生物藥劑后水稻縱卷葉螟的微生物感染狀況，但由于無法準確區(qū)分受感染樣本是哪一種水稻縱卷葉螟，所以這一領(lǐng)域的相關(guān)研究會受到極大的限制。為了解決這一難題，我們發(fā)明了這一分子生物學區(qū)分方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]提供一種準確區(qū)分兩種水稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis和Marsamiapatnalis)幼蟲的分子生物學方法，為非傳統(tǒng)分類學教育背景的相關(guān)人員提供一種可靠的區(qū)分 Cnaphalocrocis medinalis 和 Marsamia patnalis 幼蟲的方法。
[0006]一方面，本發(fā)明提供一種利用分子生物學方法準確區(qū)分兩種水稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis 和 Marsamia patnalis)幼蟲的方法，其中，該方法包括:
[0007]提取待檢測水稻縱卷葉螟幼蟲樣本的基因組DNA作為PCR的模板，利用所設(shè)計的引物對模板DNA分別進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序，并把獲得的序列與分別與檢驗序列A和檢驗序列B進行分析，與檢驗序列A吻合的是Cnaphalocrocis medinalis,與檢驗序列B吻合的是Marsamia patnalis ;其中，檢驗序列A為圖1中TEST-A所示的序列,檢驗序列B為圖1中TEST-B所示的序列。優(yōu)選的，檢驗序列A為SEQ ID NO:1所示的序列，檢驗序列B為SEQ ID NO:2所示的序列。
[0008]優(yōu)選的，用于水稻縱卷葉螟幼蟲檢測樣本基因組DNA擴增的特異性引物為上游引物 F:5’-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，和下游引物 R:5’ TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3，。
[0009]優(yōu)選的，所述的PCR擴增產(chǎn)物的系統(tǒng)為:25 μ I的PCR反應(yīng)體系，其包括:2.5 μ I的 10XPCR Buffer (Mg2+Free)、2μ I 的 dNTPs (2.5mmol/L)、1.5 μ I 的 MgCl2 (25mmol/L)、上游和下游引物、樣品基因組DNAl μ 1、0.125 μ I的Taq DNA Polymerase，再加滅菌水補足25 μ I。
[0010]另一方面，本發(fā)明提供一種把序列A和序列B在制作從分子水平上區(qū)分兩種水稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis之間差異的試劑上的用途，其中，所述的序列A為圖1中TEST-A所示的序列，序列B為圖1中TEST-B所示的序列。優(yōu)選的，檢驗序列A為SEQ ID NO:1所示的序列,檢驗序列B為SEQ ID N0:2所示的序列。
[0011]優(yōu)選的，還包括用于擴增兩種水稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis 的特異引物序列對，該特異引物為:F:5’ -ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，R:5’ TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3’。
[0012]提取這兩種縱卷葉螟幼蟲樣本的基因組DNA作為PCR的模板，利用所設(shè)計的特異性引物 F:5，-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3，，R:5’ TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3’進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物進行測序，利用基因分析軟件GENED0C對獲得的二者序列進行分析，得到兩者之間具有明顯差異的一段序列，分別被定義為檢驗序列A和B。
[0013]利用我們所設(shè)計的引物將待檢測縱卷葉螟幼蟲樣本的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物序列與檢驗序列A和檢驗序列B比較，與檢驗序列A吻合的是Cnaphalocrocismedinalis,與檢驗序列 B 吻合的是 Marsamia patnalis。
[0014]具體序列見附圖1?；蚪MDNA提取方法與【具體實施方式】中“樣本基因組DNA的提取”相同，PCR體系及擴增程序與【具體實施方式】中“PCR體系的配制” “PCR擴增程序”相同。
[0015]有益效果
[0016]本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，主要優(yōu)點有:(I)準確性高:傳統(tǒng)方法會由于不同的鑒定人對分類特征的把握的不準確性而導致鑒定結(jié)果出現(xiàn)誤差。而本發(fā)明的方法是基于PCR的分子生物學檢測鑒定技術(shù)，而目前PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展的相當成熟，擁有標準化和傻瓜化的實驗流程，保證了結(jié)果的高準確性。(2):靈敏性高:傳統(tǒng)形態(tài)學分類方法對于喪失形態(tài)學特征的樣本無法進行區(qū)分。而基于本發(fā)明的方法，只要能從樣本提取微量的基因組DNA，就能擴增到目標PCR片段，從而完成對待測樣本的檢測鑒定。
【附圖說明】
[0017]圖1檢測兩種水稻縱卷葉螟的檢驗序列A和檢驗序列B，其中，“TEST-A”和“TEST-B”為檢驗序列，
[0018]圖2田間水稻縱卷葉螟的樣本檢驗結(jié)果；其中，圖2中“SAM-l”、“SAM-2”、“SAM-3”和“SAM-4”為我們田間采集的樣品。圖2中“SAM-l”、“SAM-2”和“SAM-3”與“TEST-A”相吻合，為 Cnaphalocrocis medinalis, “SAM-4” 與“TEST-B” 相吻合，為 Marsamia patnalis
【具體實施方式】
[0019]實施例子1:檢驗序列A和B的犾得
[0020]1、樣本基因組DNA的提取
[0021]采用杭州愛思進的AxyPr印基因組DNA小量試劑盒提取樣本基因組DNA，具體操作如下:
[0022](I)將已經(jīng)過形態(tài)學特征鑒定的兩種水稻縱卷葉螟幼蟲A和B(其中A為Cnaphalocrocis medinalis, B 為 Marsamia patnalis)分別放入 1.5ml 離心管中，力口入液氮研磨成粉，加入350 μ I Buffer PBS和0.9 μ I RNase A后溫和地研磨30s。
[0023](2)收集350 μ I研磨好的組織勻漿并轉(zhuǎn)入2ml離心管。如勻漿體積不足350 μ 1，補充PBS至350 μ I。加入150 μ I Buffer C-L和20 μ I蛋白酶K。立即漩渦振蕩Imin混合均勻。短暫離心后，將離心管置56°C水浴lOmin。
[0024](3)加入 350 μ I Buffer P-D，漩渦振蕩 30s 混合均勻，12，OOOXg 離心 1min0
[0025](4)將DNA制備管置于2ml離心管中，將步驟3中的混合液移至制備管中，12, 000 X g 離心 lmin。
[0026](5)棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入500μ1 Buffer ffl,12, 000 X g 離心 lmin。
[0027](6)棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入700μ1 Buffer W2,12，000 Xg離心lmin，以同樣的方法，用700 μ I Buffer W2再洗滌一次。
[0028](7)棄濾液，將制備管置回原來的2ml離心管中，12，000 X g離心lmin。
[0029](8)將DNA制備管置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在制備管膜中央加100-200 μ IEluent或去離子水，室溫靜置lmin，12，000X g離心Imin洗脫DNA。離心管中液體即為基因組DNA。
[0030]2、PCR體系的配制
[0031]使用25 μ I 的 PCR 反應(yīng)體系，包括:2.5 μ I 的 10XPCR Buffer (Mg2+Free)、2 μ I 的dNTPs (2.5mmol/L)、l.5μ I 的 MgCl2(25mmol/L)、上游和下游引物(10ymol/L)各 I μ I (F:5’ -ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，R:5’ TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCT3’)、樣品基因組 DNAl μ 1、0.125 μ I 的 Taq DNA Polymerase,再加滅菌水補足 25 μ I。
[0032]3、PCR擴增程序
[0033]940C 4min ；95°C 40s、64°C 20s、72°C 40s (35 個循環(huán));72°C 2min 40s。
[0034]4、擴增產(chǎn)物測序
[0035]將擴增產(chǎn)物純化后加入ABI3730XL測序儀中進行序列測定。
[0036]5、序列分析
[0037]將樣品序列導入GENED0C軟件中去掉多余序列后，分別得到序列A和序列B。其中序列A為如下序列(SEQ ID NO:1):
[0038]GCTGCATAAAAACAATGA