一種檢測(cè)來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌的待測(cè)dna分子中snp位點(diǎn)的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌的待測(cè)DNA分 子中SNP位點(diǎn)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因多態(tài)性廣泛存在于各種生物體基因組。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌存在成千上萬(wàn) 的各種基因位點(diǎn)多態(tài)性和變化。這些基因多態(tài)性為研宄結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)、藥物刺激反 應(yīng)或耐藥性、菌種鑒定、以及應(yīng)對(duì)宿主的免疫反應(yīng)等方面起重要作用。
[0003] 生物芯片是一種高通量檢測(cè)基因型的強(qiáng)有力工具，廣泛應(yīng)用于各種生物體。然而 生物芯片的敏感性和特異性問(wèn)題仍然存在問(wèn)題。傳統(tǒng)雜交技術(shù)不能滿足人類(lèi)疾病樣本內(nèi)低 含量病原體檢測(cè)的需求。生物體基因組內(nèi)存在大量的基因多態(tài)位點(diǎn)，常見(jiàn)的基因多態(tài)性包 括基因轉(zhuǎn)座、插入、缺失、染色體倒位、隨機(jī)短重復(fù)序列（STR)、微衛(wèi)星以及單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)，其中，SNP是最為常見(jiàn)的基因多態(tài)性形式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組DNA分子中SNP位點(diǎn) 的試劑盒。
[0005] 本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組DNA分子中SNP位點(diǎn)的試劑盒包括生 物芯片；
[0006] 所述生物芯片為在基質(zhì)上固定多個(gè)用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)的探針組得到的芯片；
[0007] 所述用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)的多個(gè)探針組由多個(gè)探針組成，每個(gè)所述探針組對(duì)應(yīng)一個(gè) SNP位點(diǎn)；
[0008] 每個(gè)所述探針組由野生型SNP位點(diǎn)探針和突變型SNP位點(diǎn)探針組成；
[0009] 所述野生型SNP位點(diǎn)探針的3'端與野生型SNP位點(diǎn)所在靶序列相同或互補(bǔ)，且其 3'末端堿基與所述野生型SNP位點(diǎn)堿基相同或互補(bǔ)；
[0010] 所述突變型SNP位點(diǎn)探針的3'端與突變型SNP位點(diǎn)所在靶序列相同或互補(bǔ)，且其 3'末端堿基與所述突變型SNP位點(diǎn)堿基相同或互補(bǔ)。
[0011] 上述試劑盒中，所述待測(cè)結(jié)核分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis H37Rv、 結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis Q3C1551、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis 210、卡介苗 Ebovis BCG或牛結(jié)核分枝桿菌Mbovis AF2122;
[0012] 所述 SNP 位點(diǎn)為 katG-1、katG-2、katG-3、inhA-Ι 和 / 或 inhA-2 ;
[0013] 用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis H37Rv、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis Q3C1551、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis 210、結(jié)核分枝桿菌卡介苗M. bovis BCG或牛結(jié)核 分枝桿菌M. bovis AF2122的katG-1位點(diǎn)的探針組均由野生型SNP位點(diǎn)探針katG-1-C和 突變型SNP位點(diǎn)探針katG-1-A組成；所述katG-1-C探針的序列如序列表中序列1所示；所 述katG-1-A探針的序列如序列表中序列2所示；
[0014] 用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌M tuberculosis H37Rv、結(jié)核分枝桿菌M tuberculosis Q3C1551、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis 210、結(jié)核分枝桿菌卡介苗M. bovis BCG或牛結(jié)核 分枝桿菌M. bovis AF2122的katG-2位點(diǎn)的探針組均由野生型SNP位點(diǎn)探針katG-2-G和 突變型SNP位點(diǎn)探針katG-2-T組成；所述katG-2-G探針的序列如序列表中序列3所示；所 述katG-2-T探針的序列如序列表中序列4所示；
[0015] 用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis H37Rv、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis Q3C1551、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis 210、結(jié)核分枝桿菌卡介苗M. bovis BCG或牛結(jié)核 分枝桿菌M. bovis AF2122的katG-3位點(diǎn)的探針組均由野生型SNP位點(diǎn)探針katG-3-T和 突變型SNP位點(diǎn)探針katG-3-A組成；所述katG-3-T探針的序列如序列表中序列5所示；所 述katG-3-A探針的序列如序列表中序列6所示；
[0016] 用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌M tuberculosis H37Rv、結(jié)核分枝桿菌M tuberculosis Q3C1551、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis 210、結(jié)核分枝桿菌卡介苗M. bovis BCG或牛結(jié)核 分枝桿菌M. bovis AF2122的inhA-Ι位點(diǎn)的探針組均由野生型SNP位點(diǎn)探針inhA-1-A和 突變型SNP位點(diǎn)探針inhA-1-T組成；所述inhA-1-A探針的序列如序列表中序列7所示；所 述inhA-1-T探針的序列如序列表中序列8所示；
[0017] 用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis H37Rv、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis Q3C1551、結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis 210、結(jié)核分枝桿菌卡介苗M. bovis BCG或牛結(jié)核 分枝桿菌M. bovis AF2122的inhA-2位點(diǎn)的探針組均由野生型SNP位點(diǎn)探針inhA-2-C和 突變型SNP位點(diǎn)探針inhA-2-G組成；所述inhA-2-C探針的序列如序列表中序列9所示；所 述inhA-2-G探針的序列如序列表中序列10所示。
[0018] 上述所述試劑盒中，還包括用于擴(kuò)增所述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)；
[0019] 用于擴(kuò)增katG-l、katG-2和/或katG-3的引物對(duì)1由SEQ ID No. 13所示的單鏈 DNA和SEQ ID No. 14所示的單鏈DNA組成；
[0020] 用于擴(kuò)增inhA-Ι和/或inhA-2的引物對(duì)2由SEQ ID No. 15所示的單鏈DNA和 SEQ ID No. 16所示的單鏈DNA組成。
[0021] 上述試劑盒中，所述katG-Ι位點(diǎn)的核苷酸為序列11的第44位核苷酸；所述 katG-2位點(diǎn)的核苷酸為序列11的第62位核苷酸；所述katG-3位點(diǎn)的核苷酸為序列11的 第53位核苷酸；所述inhA-Ι位點(diǎn)的核苷酸為序列12的第51位核苷酸；所述inhA-2位點(diǎn) 的核苷酸為序列12的第71位核苷酸。
[0022] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種探針組。
[0023] 本發(fā)明提供的探針組由如下（I)-(IO)所述的探針組成：
[0024] (1)如序列表中序列1所示的探針katG-1-C ;
[0025] (2)如序列表中序列2所示的探針katG-1-A ;
[0026] (3)如序列表中序列3所示的探針katG-2-G ;
[0027] (4)如序列表中序列4所示的探針katG-2-T ;
[0028] (5)如序列表中序列5所示的探針katG-3-T ;
[0029] (6)如序列表中序列6所示的探針katG-3-A ;
[0030] (7)如序列表中序列7所示的探針inhA-1-A ;
[0031] (8)如序列表中序列8所示的探針inhA-l-T ;
[0032] (9)如序列表中序列9所不的探針inhAK ;
[0033] (10)如序列表中序列10所示的探針inhA-2-G。
[0034] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種試劑組。
[0035] 本發(fā)明提供的試劑組由上述探針組和引物對(duì)組成；
[0036] 所述引物對(duì)由引物對(duì)1和引物對(duì)2組成；
[0037] 所述引物對(duì)1為由SEQ ID No. 13所示的單鏈DNA和SEQ ID No. 14所示的單鏈 DNA組成；
[0038] 所述引物對(duì)2為由SEQ ID No. 15所示的單鏈DNA和SEQ ID No. 16所示的單鏈 DNA組成。
[0039] 上述試劑盒或上述探針組或上述試劑組在檢測(cè)待測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組DNA分 子中SNP位點(diǎn)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040] 上述應(yīng)用中，所述待測(cè)DNA分子為結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA全長(zhǎng)或部分片段；
[0041] 所述部分片段是由上述引物對(duì)1或引物對(duì)2擴(kuò)增得到的；
[0042] 所述 SNP 位點(diǎn)為 katG-1、katG-2、katG-3、inhA-Ι 和 / 或 inhA-2。
[0043] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組DNA分子中SNP 位點(diǎn)為突變型還是野生型的方法。
[0044] 本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組DNA分子中SNP位點(diǎn)為突變型還是野 生型的方法包括如下步驟：
[0045] (1)在上述生物芯片上用所述探針組對(duì)待測(cè)DNA分子進(jìn)行微型測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)，得 到微型測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0046] 所述微型測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)包括如下步驟：將待測(cè)DNA分子、微型測(cè)序擴(kuò)增緩沖試 劑混勻得到的混合液加入所述生物芯片上，進(jìn)行微型測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)，得到微型測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn) 物；
[0047] 所述微型測(cè)序擴(kuò)增緩沖試劑由熒光標(biāo)記的dNTP、測(cè)序酶、擴(kuò)增緩沖液和水組成；
[0048] (2)檢測(cè)所述微型測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)；
[0049] 根據(jù)所述微型測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)，按照包括如下步驟的方法確定待測(cè)DNA 分子的SNP位點(diǎn)是野生型還是突變型：若所述微型測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物在野生型探針?biāo)诘男酒?位置上有熒光信號(hào)，則待測(cè)DNA分子中SNP位點(diǎn)為或候選為野生型位點(diǎn)；若所述微型測(cè)序擴(kuò) 增產(chǎn)物在突變型探針?biāo)诘男酒恢蒙嫌袩晒庑盘?hào)，則待測(cè)DNA分子中SNP位點(diǎn)為或候選 為突變型位點(diǎn)。
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