Fgfr3單鏈抗體-魚精蛋白融合蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和生物制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種FGFR3單鏈抗體-魚精 蛋白融合蛋白的制備及其在靶向腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF)是一類由FGF基因家 族成員編碼的結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)23個成員，其中心區(qū)域都含有同源性為 30% - 70%的一段氨基酸序列。龐大的FGF家族成員作為細(xì)胞間的多功能信號分子調(diào)節(jié)著 生物體的多種生理功能。
[0003]FGFs主要通過細(xì)胞膜上的FGFR受體發(fā)揮調(diào)控功能，F(xiàn)GFR屬于酪氨酸激酶受體，是 一種單跨膜蛋白，包括與FGFs結(jié)合的細(xì)胞外部分、跨膜部分和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域3 個部分。其中細(xì)胞外部分包含著3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-likedomain,I-III)，第 1個免疫球蛋白區(qū)域被認(rèn)為與受體的自身抑制有關(guān)，第2和第3個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是FGF 配體的結(jié)合位點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域則類似于VEGF受體和TOGF受體激酶。FGF共 有4種受體，分別是FGFR1 - 4,由于存在選擇性剪切，最終可形成7種受體類型。
[0004] 在很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)FGFs及FGF受體呈異常高表達(dá)，其中以FGFR3突變或過表達(dá) 最為頻繁，已經(jīng)在多發(fā)性骨髓瘤（PlowrightEE等，1995)、尿路上皮腫瘤（A1-AhmadieHA 等，2011)、膀胱癌（PandithAA等，2010)、口腔癌（HensonBJ等，2010)、睪丸癌（Goriely A等，2009)和大腸癌（SonvillaG等，2010)等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)FGFR3激活突變或過表達(dá)。 FGFR3的異常表達(dá)參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、遷移和耐藥等多種生理功能。針對FGFR3 的抑制治療也得到了科學(xué)家們的廣泛重視。目前，阻斷FGFR3的方法主要有酪氨酸激酶抑 制劑、反義基因方法和抗FGFR3單克隆抗體。如Henson等（2010)發(fā)現(xiàn)降低FGFR3表達(dá)能明 顯抑制細(xì)胞增殖和增強(qiáng)口腔癌細(xì)胞對電離輻射的敏感性。FGFR3在放療耐受的人鱗狀細(xì)胞 癌（squamouscancer)中高表達(dá)，用FGFR3抑制劑TO173074靶向FGFR3能夠增強(qiáng)人鱗狀細(xì) 胞癌細(xì)胞的放療敏感度，并且TO173074與放療聯(lián)用的抗腫瘤效果明顯高于單獨(dú)放療或單 獨(dú)使用抑制劑（UzawaK等，2011)。FGFR3也被發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性巨球蛋白血癥（Waldenstrom macroglobulinemia，WM)細(xì)胞中過表達(dá)，F(xiàn)GFR3抑制劑Dovitinib處理能誘導(dǎo)WM細(xì)胞凋 亡和抑制細(xì)胞增殖，同時也發(fā)現(xiàn)Dovitinib與其它藥物聯(lián)用能產(chǎn)生更好的治療效果（Azab AK，2011)。然而FGFR3抑制劑不能徹底阻斷FGFR3的表達(dá)，而且FGFR3抑制劑往往具有廣譜 性，對其它酪氨酸激酶也具有一定的抑制作用，因此往往也干擾其它的酪氨酸激酶信號傳 導(dǎo)通路，產(chǎn)生了較大的毒性，限制了它的臨床應(yīng)用?？笷GF受體單克隆抗體是一種更為特異 性的阻斷FGF信號通路的途徑，很多研究都表明，它是一種更為有效的方法。FGFR3的下調(diào) 也被發(fā)現(xiàn)能明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和削弱其在異種移植小鼠內(nèi)的腫瘤發(fā)生進(jìn)程， 小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果顯示針對FGFR3的特異性抗體處理對膀胱癌和t(4 ;14)陽性的多發(fā)性骨 髓瘤都具有明顯的抗腫瘤效果（QingJ等，2009)。通過Anti-FGFR3中和抗體PRO- 001 抑制FGFR3自身磷酸化和下游的信號傳導(dǎo)，能特異性的抑制FGFR3轉(zhuǎn)化的多發(fā)性骨髓瘤細(xì) 胞生長（Trudel S等，2006)。
[0005] 盡管靶向抑制FGFR3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤組織生長，但 仍然不能從根本上根除腫瘤，因為FGF受體僅僅是腫瘤惡性生長的一個因素，其他的信號 傳導(dǎo)途徑仍然可以激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的FGFR3單鏈抗體（ScFv)與魚精蛋白的融合蛋白 (R3 - P)。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供所述R3 - P融合蛋白的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述R3 -P融合蛋白在制備靶向腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明所提供的R3 - P融合蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。
[0010] MEVQLQQSCPGLVKPSQTLSLTCAIS⑶SVSSNSAAWNWIRQSPGRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVK SRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSYYPDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQPPSV SVAPGQTARISCSGDALGDKYASWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSCIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYC QSYDGPDLWVFGGGTKLTVLGQSSGSGSARSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRS -
[0011] 本發(fā)明所提供編碼所述R3 _ P融合蛋白的基因如Seq ID No. 2所示。
[0012] ATGGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCTGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGC GCGATTAGCGGCGATAGCGTGAGCAGCAACAGCGCGGCGTGGAACTGGATTCGCCAGAGCCCGGGCCGCGGCCTGGA ATGGCTGGGCCGCACCTATTATCGCAGCAAATGGTATAACGATTATGCGGTGAGCGTGAAAAGCCGCATTACCATTA ACCCGGATACCAGCAAAAACCAGTTTAGCCTGCAGCTGAACAGCGTGACCCCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGC GCGCGCAGCTATTATCCGGATTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAG CGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGGCGCCGGGCC AGACCGCGCGCATTAGCTGCAGCGGCGATGCGCTGGGCGATAAATATGCGAGCTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAG GCGCCGGTGCTGGTGATTTATGATGATAGCGATCGCCCGAGCTGCATTCCGGAACGCTTTAGCGGCAGCAACAGCGG CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGATGAAGCGGATTATTATTGCCAGAGCTATGATGGCC CGGATCTGTGGGTGTTTGGCGGCGGCACCAAACTGACCGTGCTGGGCCAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGCGCGCAGC CAGAGCCGCAGCCGCTATTATCGCCAGCGCCAGCGCAGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCAGCTAA
[0013] 本發(fā)明含有編碼所述R3 -P的基因的載體，為含有17啟動子的原核表達(dá)載體 pET - 20b〇
[0014] 本發(fā)明含有編碼所述R3 - P的工程菌，為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0015] 本發(fā)明所述R3-P融合蛋白的制備方法，是通過在編碼所述FGFR3單鏈抗體的基因 的3'端添加編碼截斷性魚精蛋白的基因序列，從而形成融合基因，將該融合基因克隆至原 核表達(dá)載體并在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后進(jìn)行包涵體分離純化獲得融合蛋白。 [0016] 應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)密碼子的兼并性以及在不同物種中的表達(dá)偏 好，合成相應(yīng)的核苷酸序列，并將其克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主。
[0017] 本發(fā)明實驗方案，以pET - 20b為表達(dá)載體，BL21(DE3)作為宿主，制備FGFR單鏈 抗體融合蛋白的具體步驟如下：
[0018] 1)首先，合成編碼R3 - P融合蛋白的核苷酸序列：由南京鐘鼎生物公司合成該融 合基因。
[0019] 2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)R3-P:將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21 (DE3)感受 態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將篩選的陽性重組菌BL21 (DE3)/pET- 20b-R3 -P單菌落，接種到LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16h。然后按5%比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng) 基中，進(jìn)行溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間等表達(dá)條件的優(yōu)化，經(jīng)研究證實，0D值為0. 6時，ImM IPTG在37°C誘導(dǎo)3h，超聲波（100w，超聲2s，間隔2s)破菌，適于R3-P蛋白的高表達(dá)。并 以包涵體形式存在于沉淀中。
[0020] 3)分離純化R3 -P:收集菌體，破碎后離心，取沉淀進(jìn)行變性、堿性洗脫，收集洗脫 液，進(jìn)行親和層析，再經(jīng)洗滌、洗脫，即得R3 _P融合蛋白。