一種芳烴降解酶制劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種芳烴降解酶制劑及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 芳烴類物質(zhì)作為一種分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碳氫化合物，土壤環(huán)境中因富含有機 質(zhì)，芳烴的親脂性使其常被吸附在土壤顆粒表面，減弱了其可降解性；低分子量的芳烴類物 質(zhì)易揮發(fā)，具有一定的水溶性，親脂性差，是水體污染的主要部分之一。關(guān)于土壤及水體中 芳烴類有機污染物修復(fù)方法研宄已廣泛開展，包括化學(xué)修復(fù)、生物修復(fù)及化學(xué)-生物聯(lián)合 修復(fù)等多種方式。生物修復(fù)中以微生物強化修復(fù)措施的研宄和應(yīng)用最為廣泛。然而，依靠 微生物代謝有機污染物的方式進行有機污染治理存在周期較長，微生物群落易變等劣勢， 微生物群落的演替使該方法很難保證穩(wěn)定的芳烴降解能力；再有，外源微生物物種的添加 存在潛在的生態(tài)風(fēng)險，即改變固有微生物群體結(jié)構(gòu)，破壞原有生境狀態(tài)。
[0003] 生物酶劑修復(fù)技術(shù)是人為提取具有降解功能的微生物細胞內(nèi)的降解酶類，依賴于 酶對有機污染底物的直接催化加氧等作用達到高效快速降解污染物的目的，避免了有機物 分子轉(zhuǎn)移進入微生物細胞內(nèi)進行代謝的耗時過程，有效解決了功能微生物群落難以穩(wěn)定持 續(xù)存在的問題，同時回避了外源微生物群落入侵等造成的二次污染問題。酶制劑應(yīng)用的理 論基礎(chǔ)源于人們對微生物代謝石油污染物的代謝通路的認知。芳烴作為石油組成成分的一 種，主要以加氧氧化的方式開始被降解的過程。其中，真菌和細菌分別以單加氧和雙加氧的 方式將空氣中的氧添加到芳烴的環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，形成單、雙羥基化的中間分子，再通過C-0鍵 的斷裂步驟開啟開環(huán)降解的過程，并結(jié)合脫氫、加氫、水解、水合、脫羧、乙酰化等步驟逐級 代謝，最終將芳烴大分子完全礦化為〇) 2和H20。在礦化的整個酶促反應(yīng)過程中，第一步的 芳烴開環(huán)反應(yīng)被認為是限速步驟，而原核生物體的開環(huán)催化反應(yīng)多由多組件形成的酶體復(fù) 合物及輔酶的共同參與完成，各組成成員接力完成遞H和加氧的過程。由此，在多環(huán)芳烴生 物代謝的全過程中，需要單、雙加氧酶（包括NADH輔酶、鐵硫氧化還原蛋白、鐵硫氧化還原 蛋白還原酶、加氧活性中心）、脫氫酶、水解酶、水合酶、乙酰化酶等多種酶體或酶系的共同 參與。鑒于此，在有機污染治理的工程應(yīng)用中以原核生物細胞內(nèi)的混合發(fā)酵酶液作為研宄 對象，可以涵蓋多種芳烴代謝通路中的關(guān)鍵酶類，達到廣泛深度代謝的效果。
[0004] 酶作為生物蛋白類的活性物質(zhì)，離體條件下易受極端環(huán)境影響而失去功能。生物 固定化技術(shù)通過載體材料對降解酶的固定化作用，有效增強生物酶對離體環(huán)境的沖擊，提 高對極端PH、極端溫度等條件的耐受能力。同時，降解酶經(jīng)固定化所形成的酶劑提高了污染 環(huán)境中降解酶類的分布密度，疏松多孔的載體結(jié)構(gòu)又具有較高的吸附有機物分子的能力， 從而有效提高酶劑活性位點與污染底物的接觸幾率，在延長生物蛋白酶壽命的同時提高對 底物的降解效率。目前，酶固定化的方法包括吸附法（物理吸附和離子吸附）、包埋法（脂 質(zhì)體包埋、微囊型包埋和網(wǎng)格型包埋）、交聯(lián)法和共價鍵結(jié)合法等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種芳烴降解酶制劑及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0007] -種芳烴降解酶制劑，酶制劑為具有芳烴降解功能的土著微生物經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后超 聲破碎提取胞內(nèi)混合物，再經(jīng)固定化處理制成酶劑；其中，具有芳烴降解功能的土著微生 物為熒光假單胞菌，已于2011年7月22日，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號： CCTCCN0:M2011260〇
[0008] 一種芳烴降解酶制劑的制備方法，將具有芳烴降解功能的土著微生物進行誘導(dǎo)發(fā) 酵培養(yǎng)，發(fā)酵物進行超聲處理破碎細胞，而后離心收集上清液得芳烴降解粗酶液，粗酶液經(jīng) 固定化處理即為芳烴降解酶制劑。
[0009] 所述誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)是將具有芳烴降解功能的土著微生物在牛肉膏蛋白胨液體培 養(yǎng)基中于28-30°C、160-180rpm/min的條件下進行小量振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離 心、清洗并收集菌體，用與菌體等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS0.2MpH7. 5)重懸后按1-5% (v/v)的接種量將菌液接種至芳烴降解菌無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32-35°C培養(yǎng)至OD_值 為2-5,以7500-8500rpm/min離心收集菌體；上述收集的菌體采用磷酸鹽緩沖液（PBS0. 2M pH7. 5)清洗，再以7500-8500rpm/min離心收集菌體，而后加入Tris-EDTA緩沖液重懸菌 體，當菌懸液〇D6(J直為1時進行超聲破碎30-35min，超聲在冰浴條件下進行，超聲功率為 180-250W，超聲破碎后離心收集上清液即得芳烴降解菌粗酶液，粗酶液經(jīng)固定化處理即為 芳烴降解酶制劑。
[0010] 所述固定化處理是將粗酶液與固定化載體活性炭以質(zhì)量比為1:200-1:250的比 例進行混合，4-6°C條件下固定8-10h，即得芳烴降解酶制劑。
[0011] 所述芳徑降解菌無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：0. 5g/LNaCl，0. 2g/LMgS04,1. 0g/ L(NH4)2S04,2.75g/LK2HP04,2.25g/LKH2P04,0 . 02g/LCaCl2,0.02g/LFeS04，lml微量元素， pH7. 0,lg/L葡萄糖、50ppm菲、50ppm花和 50ppm苯并花。
[0012] 所述，微量元素為MnS04 ?H20, 35. 5mg/L，ZnS04 ?H20,42. 8mg/L，（NH4) 6M〇7024 ? 4H20， 32. 5mg/L〇
[0013] 所述Tris-EDTA緩沖液，其成分為：50mMpH7.9Tris、0.5mMEDTA、50mMNaCl、 5%甘油、1%TritonX-100〇
[0014] -種芳烴降解酶制劑的應(yīng)用，所述酶制劑作為污染環(huán)境中的芳烴降解酶制劑，用 于治理污染環(huán)境。
[0015] 所述酶制劑用于降解污染水體或土壤中的芳烴，進而達到修復(fù)的目的。
[0016] 所述酶制劑與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)按質(zhì)量比為1:4-1:5的比例 混合后，施用于污染水體或土壤中進行降解芳烴，進而達到修復(fù)的目的。
[0017] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0018] 本發(fā)明酶制劑以長期受石油污染馴化的土著細菌微生物為主要原料經(jīng)發(fā)酵獲得， 來源經(jīng)濟、可靠，克服了傳統(tǒng)微生物修復(fù)速率較慢、穩(wěn)定性差的缺陷；在使用過程中添加輔 助因子，提高了菌體代謝效率，能夠安全修復(fù)芳烴污染水體和土壤，且無二次污染，為有機 污染物的環(huán)境污染治理提供一種新的生物修復(fù)途徑和思路。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實施例提供的添加NADH輔助芳烴降解酶劑對水中芳烴降解效果圖， 其中，箭頭所指處為不同處理下降解速率減慢的拐點時刻。
[0020] 圖2為本發(fā)明實施例提供的添加NADH輔助芳烴降解酶劑對土壤芳烴降解效果圖， 其中，箭頭所指處為不同處理下降解速率減慢的拐點時刻。
[0021] 圖3為本發(fā)明實施例提供的電動-酶組合處理菲和芘共同污染土壤效果圖。
【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例進一步詳述本發(fā)明的相關(guān)內(nèi)容，便于對本發(fā)明進行更好地理解，但 不限定本方法。下述實施例中的試驗方法均為生物培養(yǎng)及有機物質(zhì)提取所用的常規(guī)方法。
[0023] 微生物培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為牛肉膏/蛋白胨培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基，所用緩沖液包