ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCH1及其特異性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCH1及其特異性dsRNA在小菜蛾防治 和Bt抗性治理中的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小菜蛾ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其特異性dsRNA 在害蟲(chóng)防治和Bt抗性治理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)每年都在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害農(nóng)作物并引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失。農(nóng)業(yè)害 蟲(chóng)的防治長(zhǎng)期依賴化學(xué)殺蟲(chóng)劑，然而，化學(xué)殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期使用影響了非靶標(biāo)生物的存活并 導(dǎo)致了害蟲(chóng)抗藥性、環(huán)境污染等一系列問(wèn)題嚴(yán)重危害人類身體健康。雖然已有生物殺蟲(chóng)劑 如蘇云金芽孢桿菌（AaciBy1S 簡(jiǎn)稱Bt)等被應(yīng)用于害蟲(chóng)防治中，但是其作 用時(shí)間通常比較長(zhǎng)且殺蟲(chóng)效果緩慢，推廣面積較小。目前，Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物（Bt作物）被 認(rèn)為是替代化學(xué)農(nóng)藥防治害蟲(chóng)的首選方法，且其2013年在世界范圍內(nèi)的推廣面積已超過(guò) 7500萬(wàn)公頃（James, 2013)。然而，最近田間檢測(cè)結(jié)果顯示多種害蟲(chóng)已對(duì)Bt作物產(chǎn)生了抗 性（Tabashniketal.，2011;Tabashniketal.，2013)。因此，隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，人 們迫切需要更新型的害蟲(chóng)防治方法來(lái)結(jié)合或替代Bt作物實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0004]RNA干擾（RNAinterference,簡(jiǎn)稱RNAi)是一種由雙鏈RNA(double-stranded RNA，簡(jiǎn)稱dsRNA)分子引起的轉(zhuǎn)錄后水平特異性基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾發(fā)現(xiàn)后迅速成為 了 21世紀(jì)以來(lái)的十大熱門科技之一并極大地促進(jìn)了生物基因功能的研究，因此，該技術(shù)于 2006年獲得了諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。令人興奮地是，NatureBiotechnology雜志在2007 年先后發(fā)表兩篇著名的SCI論文表明可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)靶標(biāo)害蟲(chóng)致死基因的dsRNA 來(lái)控制害蟲(chóng)，從而開(kāi)辟了利用RNA干擾技術(shù)防治田間害蟲(chóng)的新方法（Baumetal.，2007; Maoetal.，2007)。隨后，在2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲(chóng)防治方 法并討論了該方法的優(yōu)勢(shì)：（1)特異性干擾害蟲(chóng)專一基因，對(duì)高等動(dòng)物和人類安全；(2)殺 蟲(chóng)具有專一性，對(duì)非靶標(biāo)生物安全；（3)對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害。目前，基于RNA干擾的害蟲(chóng)防治 研究領(lǐng)域發(fā)展非常迅速，給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了新的科技革命的希望。然而，盡管基于RNA 干擾的害蟲(chóng)防治新方法具有很大優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)基于RNA干擾的害蟲(chóng)有效治理的關(guān)鍵是篩選出 合適的對(duì)害蟲(chóng)高效致死的靶標(biāo)基因。
[0005]昆蟲(chóng)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-bindingcassettetransporter,簡(jiǎn)稱ABC transporter)基因超家族共包括ABCA-ABCH這8個(gè)亞家族，每個(gè)亞家族又包括多個(gè)基因， 不同亞家族的基因具有不同的生物學(xué)功能。其中，ABCH亞家族是一個(gè)比較特殊的ABC轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白亞家族，它只存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物硬骨魚(yú)類中，高等動(dòng)物和人類中沒(méi)有該ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族的基因。ABCHl基因是ABCH亞家族中的一個(gè)基因，它可以參與昆蟲(chóng)的脂質(zhì) 轉(zhuǎn)運(yùn)等重要的生物學(xué)過(guò)程，本研究發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)缺失該基因的表達(dá)后表現(xiàn)為明顯的致死表型。 由于高等動(dòng)物和人類中并沒(méi)有該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，故對(duì)該基因進(jìn)行RNA干擾是非常安全 的。由于該基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域部分在不同昆蟲(chóng)中分化較大，因此可以在該區(qū)域設(shè) 計(jì)特異性的dsRNA進(jìn)行專一的害蟲(chóng)防治而不影響其他非靶標(biāo)昆蟲(chóng)。更重要的是，我們研究 發(fā)現(xiàn)該基因與昆蟲(chóng)Bt抗性無(wú)關(guān)，在BtCrylAc殺蟲(chóng)蛋白抗性昆蟲(chóng)中對(duì)該基因進(jìn)行RNA干擾 后同樣表現(xiàn)出明顯的致死表型，這表明該基因可以同時(shí)用于昆蟲(chóng)防治和Bt抗性治理。
[0006] 因此，以害蟲(chóng)關(guān)鍵生理功能基因ABCHl作為基于RNA干擾的害蟲(chóng)防治和Bt抗性治 理的分子靶標(biāo)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制靶標(biāo)害蟲(chóng)該基因表達(dá)的害蟲(chóng)防治新策略具有明顯的商 業(yè)價(jià)值和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)以上現(xiàn)有化學(xué)防治技術(shù)存在的各種問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲(chóng)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCHl的序列及其dsRNA在防治小菜蛾和治理小菜蛾Bt抗性中的應(yīng)用，相對(duì) 于傳統(tǒng)的化學(xué)防治技術(shù)，該技術(shù)具有高效低毒、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明提供一種昆蟲(chóng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCH1，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所 示。該序列是在小菜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組中搜索找到的一個(gè)基因片段的基礎(chǔ)上，通過(guò)cDNA末端 快速擴(kuò)增（rapidamplificationofcDNAends,簡(jiǎn)稱RACE)技術(shù)進(jìn)一步克隆得到的全長(zhǎng) cDNA序列。該cDNA序列全長(zhǎng)3556bp，其中開(kāi)放閱讀框（openreadingframe,簡(jiǎn)稱0RF)為 2313bp，編碼含有770個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白序列如SEQIDNO. 2所示，此外，其5'-UTR (untranslatedregion,簡(jiǎn)稱UTR)為llObp，3'-UTR為 1133bp。
[0009] 本發(fā)明還提供一種昆蟲(chóng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCHl的基因片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 3所示，是根據(jù)SEQIDNO. 1的氨基酸序列SEQIDNO. 2分析得到的特有跨膜結(jié)構(gòu) 域（transmembranedomain,簡(jiǎn)稱TMD)，設(shè)計(jì)出含有23-bp的17啟動(dòng)子的特異性正向引物 SEQIDNO. 4和反向引物SEQIDNO. 5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)一步 使用T7Ribomax?ExpressRNAiSystem(Promega,Madison,WI,USA)試劑盒并按照其 說(shuō)明書(shū)經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄合成的。
[0010] 本發(fā)明還提供一種dsRNA(由SEQ ID NO. 3合成）在致死Bt CrylAc敏感和抗性 小菜蛾中的應(yīng)用：顯微注射該dsRNA到小菜蛾3齡初幼蟲(chóng)體腔中，結(jié)果顯示，該dsRNA可以 特異性地沉默小菜蛾ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCHl的mRNA表達(dá)，并導(dǎo)致小菜蛾在幼蟲(chóng)期和隨后 的蛹期死亡。由此可見(jiàn)，該dsRNA可以同時(shí)用于小菜蛾的防治和Bt抗性治理。
[0011] 本研究通過(guò)注射發(fā)現(xiàn)害蟲(chóng)關(guān)鍵生理功能基因ABCHl的特異性dsRNA可以致死Bt 敏感和抗性的害蟲(chóng)，從而證明ABCHl的特異性dsRNA可以作為基于RNA干擾的害蟲(chóng)防治和 Bt抗性治理的分子靶標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入該害蟲(chóng)關(guān)鍵生理功能基因ABCHl的特異 性dsRNA來(lái)抑制靶標(biāo)害蟲(chóng)該基因的表達(dá)并致死靶標(biāo)害蟲(chóng)，從而達(dá)到田間害蟲(chóng)治理的目的。 因此，基于害蟲(chóng)關(guān)鍵生理功能基因ABCHl的轉(zhuǎn)基因RNA干擾技術(shù)是一種害蟲(chóng)防治新策略，它 具有明顯的商業(yè)價(jià)值和應(yīng)用前景?？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明具有以下有益效果如下， (1)特異性干擾害蟲(chóng)專一基因，對(duì)高等動(dòng)物和人類安全；(2)殺蟲(chóng)具有專一性，對(duì)非靶 標(biāo)生物安全；（3)對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害。因此，本發(fā)明相對(duì)于傳統(tǒng)的害蟲(chóng)防治方法具有明顯的技 術(shù)優(yōu)勢(shì)。
[0012]
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1 :為小菜蛾ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCHl功能結(jié)構(gòu)域分布示意圖。長(zhǎng)方形表示該 基因的跨物種保守的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-bindingdomain,簡(jiǎn)稱NBD)，堅(jiān)條長(zhǎng)方 形表示該基因的物種特有的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembranedomain,簡(jiǎn)稱TMD)中的6個(gè)跨膜 區(qū)。本研究中設(shè)計(jì)的ABCHl基因特異性dsRNA區(qū)域已標(biāo)出。
[0014] 圖2 :小菜蛾BtCrylAc敏感種群DBMlAc-S和小菜蛾CrylAc抗性近等基因系種 群NIL-R的4齡幼蟲(chóng)中腸的ABCHl基因mRNA的表達(dá)量檢測(cè)，用L32基因作為內(nèi)參基因，相 同字母表不無(wú)顯著性差異（P> 0.05;Holm-Sidak'stest;n= 3)。
[0015] 圖3 : (A)小菜蛾BtCrylAc敏感種群DBMlAc-S的3齡初幼蟲(chóng)顯微注射SEQID NO. 3合成的dsRNA后，在0 - 120h內(nèi)每隔24h檢測(cè)一次ABCHl基因的mRNA表達(dá)量情況，用 L32基因作為內(nèi)參基因；(B)注射dsRNA后0-120h內(nèi)每隔24h統(tǒng)計(jì)一次小菜蛾幼蟲(chóng)的死亡 率情況。注射Bu