重組生物體3 - 羥基丙酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種重組生物體3 -羥基丙酸的制備方法。_2] 發(fā)明背景
基因工程技術(shù)，允許轉(zhuǎn)移的物種和許可證之間的遺傳性狀，特別是從一個物種轉(zhuǎn)移酶給他人。這些技術(shù)已達到商業(yè)化的具有高附加值的產(chǎn)品，如藥品。的基因工程技術(shù)中是同樣適用的和成本有效的時，適用于基因和酶可用于進行基本的化工原料。
[0003]還存在于細菌肺炎克雷伯菌，它有能力從甘油生物生產(chǎn)3 -羥基丙甲代謝途徑。原生微生物的能力，從甘油生產(chǎn)1，3 -丙二醇，以及。商業(yè)利益正在探索生產(chǎn)1，3 -丙二醇，甘油或葡萄糖，重組已設(shè)計，以表達必要的酶，用于生產(chǎn)1，3 -丙二醇從其他生物的生物體。
[0004]3 -羥基丙酸是一個3個碳原子的有機分子。這種分子的IUPAC命名的名稱是3-輕基丙酸。它也被稱為3 -輕基丙酸甲酯。beta, hydroxprop1nic的酸,beta.-輕基丙酸甲酯，3 -輕基丙酸,3 -輕基丙,輕基丙酸,乳酸乙烯,beta.-乳酸和2 deoxyglceric酸。3-HP中的應(yīng)用包括制造可吸收的假體裝置和外科手術(shù)縫合線，β -內(nèi)酰胺的摻入，制備丙烯酸，形成的trifluromethylated醇或二醇，的polyhydroxyalkonates,和乳酸的共聚物，具有。3-HP現(xiàn)在普遍用于商業(yè)用途所產(chǎn)生的有機化工合成。3-HP的生產(chǎn)及銷售的這些方法相對昂貴，并且將使用它的單體的聚合物的制造生產(chǎn)成本高昂。正如下面所討論的，一些生物是已知的生產(chǎn)3_HP。然而，尚未提供一個目錄，從這些生物體的基因，從而合成3-HP使用的酶本身負責(zé)的本機主機產(chǎn)生它不存在于該分子的合成能力。
[0005]3-HP在除了其商業(yè)實用程序，它被發(fā)現(xiàn)在許多生物過程，包括許多天然存在的生物聚合物。聚(3 -羥基丁酸酯)(PHB)的微生物的聚酯，含有羥基的單體稱為polyhydroxyalkonates 酯(PHAs)是最豐富的部件。
[0006]PHA的含有3-HP發(fā)表的研究大部分集中在兩個細菌來源:青枯雷爾氏桿菌(“產(chǎn)堿eutrophus”)和假單胞菌oleovorans的。氧產(chǎn)堿桿菌和假單胞菌oleovorans能夠生長在無氮培養(yǎng)基中的3 -羥基丙酸，1，5 -戊二醇或1，7 -庚二醇。當3-HP是主要的羥基酸，聚(3 -羥基丁酸酯-共-3 -羥基丙酸)加入到生長培養(yǎng)基含有7% (摩爾)3 -羥基丙酸的形成。這些細胞也存儲的3%，3 -羥基丙酸的聚(3 - 丁酸酯-共-3 -羥基丙酸)。
[0007]重組系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建PHA的。氧產(chǎn)堿桿菌無論從設(shè)計，以表達PHA合成酶的大腸桿菌菌株生產(chǎn)聚(3 -羥基丙酸)當喂1，3 -丙二醇。在細菌的途徑，甘油轉(zhuǎn)化為1，3 -丙二醇，甘油脫水酶，催化轉(zhuǎn)化甘油3 -羥基丙醛和水。這種酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在一個包括檸檬酸桿菌屬，克雷伯氏菌屬，乳桿菌屬，梭狀芽孢桿菌菌株的細菌數(shù)。在1，3 -丙二醇的通路的第二酶1，3 -丙二醇氧化還原酶(EC 1.1.202)降低1，3 -丙二醇中的NADH依賴性反應(yīng)。甘油，1，3 -丙二醇的轉(zhuǎn)化率的途徑已在大腸桿菌中表達。Tong等，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)57 (12) 3541-3546。用于生產(chǎn)1，3 -丙二醇的基因進行了克隆從肺炎克雷伯菌的DHA的調(diào)節(jié)子。甘油甘油促進被運送到細胞中，和然后由一個輔酶依賴B.sub.12的脫水轉(zhuǎn)化成3 -羥基丙醛。大腸桿菌缺乏一個土生土長的調(diào)節(jié)因子，因此大腸桿菌不能有氧增長甘油沒有外源電子受體，如硝酸鹽或富馬酸。
[0008]醛脫氫酶的酶催化的醛氧化成羧酸。在各種各樣的生物體，例如，非特異性醛脫氫酶的編碼基因已被確定，ALDH2從智人，ALD4從釀酒酵母，和來自大腸桿菌的ALDA aldB。分類的這些酶的輔因子的使用，需要要么AND.sup。+或NADP.sup的。+和一些將使用任一輔因子。挑出在這里提及的基因能夠作用于若干不同的醛，很可能，它們可以是能夠氧化3 -
羥基丙醛，3 -羥基丙酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是，允許創(chuàng)建的重組微生物宿主，其能夠從甘油或葡萄糖為起始原料合成3-HP。甘油或葡萄糖轉(zhuǎn)化，然后轉(zhuǎn)換為3-HP。此過程需要所謂的DHAB從肺炎克雷伯菌的基因，其編碼的酶甘油脫水四個不同的醛脫氫酶基因中的任一項的轉(zhuǎn)換3-HPA 3-HP。四醛脫氫酶基因從細菌大腸桿菌，ALDH2的人類，從釀酒酵母，大腸桿菌aldB ALD4阿爾達。酵母基因出現(xiàn)，以得到最佳的效果。
[0010]本發(fā)明的一個目的是提供一種編碼甘油脫水酶和所需的3 -羥基丙酸的生產(chǎn)從甘油醛脫氫酶的基因構(gòu)建。
[0011]這也是本發(fā)明的一個目的是提供一種方法，用于從甘油生產(chǎn)3 -羥基丙酸。
[0012]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的優(yōu)選實施例從下面的描述和從權(quán)利要求書中。
【具體實施方式】
[0013]據(jù)透露，在這里，它可以引入到細菌宿主基因編碼兩種酶，從而賦予該主機的能力，以產(chǎn)生3-HP從甘油。這兩個必要的酶甘油脫氫酶和乙醛脫氫酶。這里報道，這兩種酶是必需的，足以使合適的宿主的菌株，如大腸桿菌菌株主管，從甘油中，以3-HP。一個示例性的編碼甘油脫水酶的基因是已知的，DHAB肺炎克雷伯菌，基因的測序和呈現(xiàn)的方便使用。幾個示例性的醛脫氫酶是已知的，在這里，它們的序列。從這些信息中，就變成實際甘油轉(zhuǎn)換成3-HP的能力，以商業(yè)上合理的方式賦予細菌宿主。
[0014]這是看不出來的工作完成之前這里描述的，這兩個不同的酶，可以制造在一個共同的主機產(chǎn)生的能力，使3-HP。有許多已知的醛脫氫酶基因，已知有不同的底物特異性和效率的酶。沒有證據(jù)，這里所描述的工作之前，，醛脫氫酶工作上的(3-HPA)襯底上創(chuàng)建3-HP。如果沒有這些知識，沒有預(yù)測3-HP生產(chǎn)下面描述的研究的有效性的數(shù)據(jù)。一個額外的不確定性來自中間體醛，3-HPA，是有毒的到許多細菌宿主，宿主的存活依賴于酶的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化的醛中間體無毒3的相對速率的事實-HP。
[0015]在這里生產(chǎn)的3-HP實現(xiàn)所需的一個困難，從非本地主機的核糖體結(jié)合位點往往是無效的，并導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)差，而且許多非本土發(fā)起人往往不轉(zhuǎn)錄和酒吧高蛋白表達。然而，本發(fā)明還認識到，非天然啟動子，被稱為是非常活躍的，是通過添加一個小的分子表達的途徑無關(guān)的誘導(dǎo)通常是一個非常有效的方式來表達和調(diào)節(jié)表達的酶的水平宿主(如大腸桿菌)。為了實現(xiàn)高層次的調(diào)控基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建置于trc啟動子的調(diào)控下，從甘油生產(chǎn)3 -羥基丙酸，所有必要的外源基因表達。trc啟動子，高效，原產(chǎn)于大腸桿菌，IPTG此外誘導(dǎo)。
[0016]本說明書中描述了一種從甘油3 -羥基丙酸的生產(chǎn)中使用的遺傳構(gòu)建。遺傳構(gòu)建包括示例性的DNA序列，編碼甘油脫水酶和醛脫氫酶編碼的DNA序列的表達的。甘油脫水酶的表達所必需的示例性序列的一組統(tǒng)稱為“DHAB。醛脫氫酶的表達所必需的序列的一組包括四個不同的基因，被證明是有效的任何一個。
[0017]生產(chǎn)3-羥基丙酸
在下面所描述的工作，3 -羥基丙酸，甘油在大腸桿菌中生產(chǎn)所需的酶，trc啟動子，通過加入IPTG誘導(dǎo)的非天然啟動子的調(diào)控下表達。DHAB肺炎克雷伯氏菌的基因所編碼的，該甘油脫水酶，醛脫氫酶，使用任何一個的四個不同的基因，ALD4從釀酒酵母中，從大腸桿菌或從大腸桿菌ALDA的表達，這些基因編碼甘油脫水酶和編碼醛脫氫酶的基因的任何一個的時間是足以使構(gòu)建體生產(chǎn)3-HP的發(fā)酵介質(zhì)時以甘油。DHAB基因在所有的這些結(jié)構(gòu)中，從所使用的醛脫氫酶的編碼基因的下游，這兩個基因的表達由trc啟動子的調(diào)控。這樣的順序，但是，并不需要一個結(jié)構(gòu)上和使用上的多個構(gòu)造一族的順序是可能的。
[0018]在最小的遺傳構(gòu)建根據(jù)這里所給出的數(shù)據(jù)，唯一的遺傳元件，這將是必要的本的DHAB的結(jié)構(gòu)基因編碼一種蛋白質(zhì)，它有效地催化氧化3 -羥基丙酸，3 -羥基丙醛的醛脫氫酶基因和非天然啟動子序列的選擇，得到最適合其構(gòu)建的過程中要使用的上下文中不同的誘導(dǎo)控制。構(gòu)造中是否保留或增加從其他的DNA序列，外源的DNA片段，將不一定是有效的3-HP合成由宿主生物體是不利的，但就沒有必要了。必定受到前面翻譯的每個序列編碼感興趣的蛋白質(zhì)的信使RNA，使核糖體翻譯的核糖體結(jié)合位點，在選定的主機功能。也將是必要的緊下游的終止子序列的每一個翻譯單元在一些生物體，特別是在真核細胞。該構(gòu)造可以是自主復(fù)制的序列的一部分，如質(zhì)粒或噬菌體載體中，或可以整合到宿主的基因組中。
[0019]通過使用限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)基因和合適的啟動子(次)可被分離，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，由相應(yīng)的寡核苷酸的化學(xué)合成的，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他方法，在本技術(shù)領(lǐng)域和分子生物學(xué)。子(S)將來自其他生物的基因組DNA或人工基因結(jié)構(gòu)含有發(fā)起人。將合適的啟動子片段連接到幾種可能的安排中任一項的結(jié)構(gòu)基因