一種抗腫瘤融合蛋白EL-defensin、其編碼基因和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥用蛋白技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種抗腫瘤融合蛋白、其編 碼基因、以該融合蛋白為活性成分的藥物以及其制藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人的防御素（defensin)由粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，從遺傳學(xué)上分為a -防御素和 3-防御素。它們?cè)谔烊幻庖叻矫嬷饕憩F(xiàn)為殺死病原微生物和帶有包膜的病毒，而在獲 得性免疫方面主要表現(xiàn)作為化學(xué)誘導(dǎo)劑和激活免疫細(xì)胞。a-防御素（HNP1-3)在腫瘤細(xì) 胞中超表達(dá)，而0 -防御素（HBD)在腫瘤細(xì)胞中極少表達(dá)，并且最近研究表明hBD-1可以作 為腫瘤的抑制基因。尤其近年來研究表明HBD-1與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移有重要的 聯(lián)系。例如，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞中HBD-1的超表達(dá)，能夠抑制前列腺癌細(xì)胞系DU145和PC3 的增殖，裂解細(xì)胞并且啟動(dòng)caspase蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；HBD-1刺激口腔鱗癌細(xì)胞BHY，使 BHY細(xì)胞中HBD-3表達(dá)量增加，并且抑制細(xì)胞的增長(zhǎng)；小腸基底HIF-1a是DEFB1能夠表達(dá) 所必需的，DEFB1是腸上皮細(xì)胞中HIF-la的靶點(diǎn)，而HIF-la的超表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移 和腫瘤血管的增生。
[0003] 輔基蛋白（LDP)是力達(dá)霉素LDM的蛋白部分，可以通過基因工程的方法制備。先 前報(bào)道LDP可以與腫瘤組織特異性結(jié)合，其本身在體內(nèi)也具有中等程度的抗腫瘤作用，并 且物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。因此，LDP以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及抗腫瘤特性，可以作為 開發(fā)新型抗腫瘤藥物的支架載體。
[0004] 表皮生長(zhǎng)因子受體（eipermal growth factor receptor, EGFR)是跨膜受體酪氨 酸激酶家族（ErbB)的一員，其配體有EGF、TGF-a、Amphiregulin、HB-EGF等，配體和受體 結(jié)合，進(jìn)而活化一系列的胞內(nèi)信號(hào)通絡(luò)，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和遷移。EGF是EGFR 的天然配體之一，由53個(gè)氨基酸組成，含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，形成3對(duì)二硫鍵， Cysl_Cys3形成A環(huán)，Cys2_Cys4形成B環(huán)，Cys5_Cys6形成C環(huán)，EGF與受體結(jié)合的區(qū)段位 于C環(huán)。
[0005] 基于上述，本發(fā)明研發(fā)了以輔基蛋白LDP為支架的新型抗腫瘤融合蛋白，其具有 EGFR靶向性和防御素HBD-1殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種以LDP為支架具有靶向EGFR的防御素（HBD-1)的 融合蛋白，該融合蛋白為具有抗腫瘤作用的分子量較小的藥用蛋白。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該融合蛋白的編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供以上述融合蛋白為活性成分的藥物以及上述融合 蛋白的制藥用途。
[0009] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：
[0010] 迄今為止，在國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)防御素（defensin)抗腫瘤的研究中，防御素 (defensin)主要是通過真核表達(dá)系統(tǒng)獲得的。但是，防御素含有三個(gè)二硫鍵，不易可溶性 表達(dá)，并且表達(dá)量極少，難以獲得高純度的防御素分子?？赡苁且?yàn)榉烙胤肿与y以表達(dá)， 關(guān)于防御素的融合蛋白的報(bào)道極少，目前尚無關(guān)于防御素的融合蛋白的報(bào)道，更沒有將防 御素與具有靶向性的部分或分子相融合的報(bào)道。本發(fā)明人通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了以LDP 為支架的、具有靶向EGFR特異性的防御素（HBD-1)融合蛋白（本文命名為EL-defensin)重 組載體，將其轉(zhuǎn)化到工程菌BL21star TM(DE3)中表達(dá)，并經(jīng)純化獲得了一種多功能的具有抗 腫瘤作用的藥用蛋白。其中，除表達(dá)的蛋白含量外，關(guān)于EGFR靶向性，發(fā)明人選取了與EGFR 受體結(jié)合的EGF重要結(jié)構(gòu)C環(huán)，其上22個(gè)氨基酸殘基作為導(dǎo)向分子，由此形成的較小分子 的蛋白也更容易穿透組織的細(xì)胞外間隙，到達(dá)實(shí)體腫瘤的深部。
[0011] 因此，一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一級(jí)氨基 酸序列結(jié)構(gòu)：
[0012] EGFR特異性靶向寡肽-連接肽1-輔基蛋白LDP-連接肽2-防御素（HBD-1);
[0013] 其中，所述EGFR特異性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22個(gè)氨 基酸；所述輔基蛋白LDP具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110個(gè)氨基酸；所述防御 素HBD-1具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共36個(gè)氨基酸。
[0014] 在該融合蛋白中，連接EGFR特異性靶向寡肽與輔基蛋白LDP的連接肽1以及連 接輔基蛋白LDP與防御素HBD1的連接肽2可以相同或不同。優(yōu)選地，所述連接肽1為 (GGGGS)2，所述連接肽2為（GGGGS) 2。在選擇連接肽時(shí)，需考慮如連接肽太短，則剛性大， 不利于蛋白分子伸展，容易造成蛋白分子構(gòu)想相互遮掩，影響蛋白功能；并且考慮到作為 支架的輔基蛋白LDP共有110個(gè)氨基酸，具有a螺旋和0折疊，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，因此，選用 (GGGGS)2。
[0015] 優(yōu)選地，所述融合蛋白具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白 具有SEQIDN0:5所示的氨基酸序列；
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示或SEQ ID N0:5。
[0017] SEQ ID N0:4為本發(fā)明提供的一個(gè)具體融合蛋白的氨基酸序列，共188個(gè)氨基 酸。從氨基端至羧基端，該融合蛋白包括：EGFR特異性靶向寡肽（Ec)，共22個(gè)氨基酸；連 接肽1，為（GGGGS) 2柔性肽，共10個(gè)氨基酸；輔基蛋白LDP，共110個(gè)氨基酸；連接肽2,為 (GGGGS)2柔性肽，共10個(gè)氨基酸；防御素HBD-1 (HBD-1)，共36個(gè)氨基酸。
[0018] SEQ ID N0:5為本發(fā)明提供的另一個(gè)具體融合蛋白的氨基酸序列，共192個(gè)氨基 酸。相比于SEQ ID N0:4,該融合蛋白在EGFR特異性靶向寡肽之前具有Met和Ala，在防御 素的C端具有Leu和Glu。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供上述融合蛋白的編碼基因。
[0020] 優(yōu)選地，所述編碼基因具有SEQ ID N0:6或7所示的核苷酸序列；
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:6或7所示。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物，所述藥物以本發(fā)明提供的上述融合蛋 白為活性成分。優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物用于治療或預(yù)防鱗癌、肺癌或胰腺癌，優(yōu)選肺癌。
[0023] 又一方面，本發(fā)明還提供上述融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用途。優(yōu)選地，所述 抗腫瘤藥物用于治療或預(yù)防鱗癌、肺癌或胰腺癌，優(yōu)選肺癌。
[0024] 綜上，本發(fā)明應(yīng)用基因工程的方法提供了一種新型的具有殺傷性、靶向性的融合 蛋白。該融合蛋白為靶向EGFR (表皮生長(zhǎng)因子受體)、且含有LDP和defensin的新型蛋白。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的融合蛋白具有以下實(shí)質(zhì)性區(qū)別和效果：
[0025] 在現(xiàn)有技術(shù)中，尚無將防御素與其它部分或分子、特別是具有靶向性的部分或分 子相融合形成融合蛋白的報(bào)道。其原因可能在于，人的防御素分子HBD-1含有三個(gè)二硫鍵， 因此在原核細(xì)胞中極其難以表達(dá)，且常常以包涵體的形式表達(dá)，并且由于其分子空間結(jié)構(gòu) 復(fù)雜，其不易和其它蛋白融合表達(dá)。
[0026] 而在本發(fā)明提供的融合蛋白中，以LDP作為支架，將防御素與EGFR的配體寡肽融 合，其中EGFR的配體寡肽為靶向分子，防御素HBD-1為彈頭，從而構(gòu)建了一個(gè)靶向EGFR的 彈頭小分子藥物。這樣就實(shí)現(xiàn)了直接表達(dá)獲得包含防御素的蛋白分子。實(shí)驗(yàn)證明，所得到 的融合蛋白不僅保留了 defensin殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而且能更特異地靶向腫瘤組織，因 此具有更好的殺傷腫瘤的優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物體內(nèi)具有良好的抗腫瘤效果，相比于單獨(dú)應(yīng)用各部 分，其技術(shù)效果更顯著。并且，即使本領(lǐng)域已有一些將LDP作為支架構(gòu)建融合蛋白的報(bào)道， 但是，現(xiàn)有的此類融合蛋白往往是使LDP起組裝彈頭分子AE的作用，與本發(fā)明提供的融合 蛋白具有本質(zhì)區(qū)別，并且往往具有毒性大、無靶向性等缺點(diǎn)。