。
[0057] ②使用探針I(yè)I的結(jié)果如下：
[0058] 不管加不加入空白沉默液，保溫5分鐘還是3小時，四個反應均呈綠色，說明探針 I的前面9個堿基在設計的時候是必要的，前9個堿基與NaCl同時存在才能起到沉默空白 的作用。
[0059] (5)可視化擴增：反應體系為：10XPCRbuffer5ii1，dNTP(2. 5mMeach)2ii1，DNA PolymeraseI酶（5U/iil)0. 5iil，1X01490(20iiM)liil，步驟（3)得到的含COI片段的溶液 1111，探針1(2〇11]\〇或探針11(2〇11]\〇4111，(1(111 20補足至5〇111。反應條件為：941：3111111; 94°〇308、501：308、721：458,30個循環(huán)。空白以(1(11120代替含〇)1片段的溶液。同時以水 代替含C0I片段的溶液，作為模板，相當于空白對照。
[0060] (6)顯色：向可視化PCR擴增產(chǎn)物中加入空白沉默液（1. 714M的NaCl溶液）7iU， 95°C保溫 5min，以 1°C/min的速度降溫至 25°C保溫 30min。加入hemin(108iiM)liil，25°C 保溫60min。加入H202 (126mM)和ABTS2_(126mM)按體積比1 :1混合得到的混合物物2ill。
[0061] 反應結(jié)果如下：
[0062] 加入探針I(yè)I的空白對照和試驗管都顯色了，這是由于探針I(yè)I中的G-四聯(lián)結(jié)構穩(wěn) 定存在反應體系中，且具有DNAzyme功能。加入探針I(yè)的空白對照為無色，試驗管呈現(xiàn)綠色。 這是由于探針I(yè)的前9個堿基能與G-四聯(lián)結(jié)構中的一段互補，讓樣本為非美洲大蠊（包括 空白和其他種的蜚蠊）的時候，在95°C升溫打破DNA二級結(jié)構，降溫的時候前9個堿基與 G-四聯(lián)結(jié)構的一段優(yōu)先形成9個堿基的互補雙鏈而防止G-四聯(lián)二級結(jié)構的重生，從而破 壞G-四聯(lián)結(jié)構，使其不具DNAzyme功能，不能催化顯色。陽性樣品由于模板特異片段的存 在，美洲大蠊probe的特異片段在可視化PCR擴增過程中退火與美洲大蠊特異片段形成雙 鏈，在DNAPolymerase15' 一3'外切酶活性下將前9個堿基切割而使得美洲大蠊probe 的G-四聯(lián)結(jié)構在降溫過程中得以形成而具有DNAzyme功能，能催化顯色?？梢暬锾结?設定為探針I(yè)。
[0063] 實施例2
[0064] (1)樣本如下：以下采集到的昆蟲均分別按"陸寶麟?yún)呛裼?中國重要醫(yī)學昆蟲分 類與鑒別[M].河南科學技術出版社，2003,634"進行鑒定，且都委托中山大學生命科學學 院進行鑒定復核。
[0065]①以廣東中山新鮮采集的美洲大蠊成蟲（在廣東中山采集）、取同一批的若蟲及 其卵各一只，其余的飼養(yǎng)成成蟲后鑒定為美洲大蠊；
[0066] ②與美洲大蠊同屬的澳洲大蠊成蟲（在廣東中山采集）取同一批的若蟲及其卵各 一只，其余的飼養(yǎng)成成蟲后鑒定為澳洲大蠊；
[0067] ③與美洲大蠊同科的麗郝氏蠊成蟲（在廣東中山采集）取同一批的若蟲及其卵各 一只，其余的飼養(yǎng)成成蟲后鑒定為麗郝氏蠊；
[0068] ④與美洲大蠊不同科但同目的德國小蠊成蟲（在廣東中山采集）取同一批的若蟲 及其卵各一只，其余的飼養(yǎng)成成蟲后鑒定為為德國小蠊；
[0069] (2)提取基因組DNA:使用基因組DNA提取試劑盒（TIANampGenomicDNAKit)分 別提取不同樣本的成蟲、若蟲或卵的基因組DNA。
[0070] (3)C0I片段的獲得：同實施例1步驟（3)，得到成蟲、若蟲、卵的C0I片段。同時， 為了避免假陽性結(jié)果，設置陰性對照（以水為模板）。
[0071] (4)可視化擴增：同實施例1步驟（5)。
[0072] (5)顯色：同實施例1步驟（6)。
[0073] 結(jié)果如下：
[0074] ①以美洲大蠊的成蟲、若蟲和卵分別提取得到的C0I片段為模板：
[0075] A、可視化擴增采用探針I(yè)，結(jié)果為：成蟲、若蟲和卵均呈現(xiàn)綠色，空白為無色透明；
[0076]B、可視化擴增采用探針I(yè)I，結(jié)果為：成蟲、若蟲、卵和空白均呈現(xiàn)綠色。
[0077] ②以澳洲大蠊的成蟲和若蟲分別提取得到的C0I片段為模板：
[0078] A、可視化擴增采用探針I(yè)，結(jié)果為：成蟲、若蟲、卵和空白均為無色透明；
[0079]B、可視化擴增采用探針I(yè)I，結(jié)果為：成蟲、若蟲、卵和空白均呈現(xiàn)綠色。
[0080] ②以麗郝氏蠊的成蟲、若蟲和卵分別提取得到的C0I片段為模板：
[0081]A、可視化擴增采用探針I(yè)，結(jié)果為：成蟲、若蟲、卵和空白均為無色透明；
[0082]B、可視化擴增采用探針I(yè)I，結(jié)果為：成蟲、若蟲、卵和空白均呈現(xiàn)綠色。
[0083] ②以德國小蠊的成蟲、若蟲和卵分別提取得到的C0I片段為模板：
[0084] A、可視化擴增采用探針I(yè)，結(jié)果為：成蟲、若蟲、卵和空白均為無色透明；
[0085]B、可視化擴增采用探針I(yè)I，結(jié)果為：成蟲、若蟲、卵和空白均呈現(xiàn)綠色。
[0086] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 設計美洲大蠊的可視化探針序列，如下： 探針I(yè)，方向為5' -3' ： CCCTACCCAI AACT TTAT TACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGG ATGGGTAGGGCGGGTTGGG ； 其中，方框框住部分為前綴序列；與劃橫線部分序列反向互補，起到沉默空白的作用； 粗體字部分為G-四聯(lián)結(jié)構； (2) |旲板DNA的提?。禾崛〈龣z標本的基因組DNA ; (3) C0I序列的制備：以步驟（2)得到的基因組DNA為模板，以LC01490和HC02198為 引物對進行PCR反應，再將PCR產(chǎn)物純化，得到COI序列； LC01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ； HC02198 :5, -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3,； (4) 可視化擴增：以步驟⑶得到的COI序列為模板，以LC01490和探針I(yè)為引物對進 行PCR反應； (5) 顯色和結(jié)果判斷：向步驟（4)得到的可視化擴增產(chǎn)物中加入NaCl溶液，變性和復 性；接著加入氯鐵血紅素反應，再加入H2O 2和ABTS%觀察顏色變化；顏色變?yōu)榫G色，表示待 檢樣品為美洲大蠊；顏色沒有發(fā)生變化，表示待檢樣品非美洲大蠊。
2. 根據(jù)權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟⑶中所述 PCR反應的體系為：10XPCR buffer5y 1，每種脫氧核苷酸濃度為2. 5mM的dNTP2y 1，濃 度為 5υ/μ 1 的 EX Taq 酶 0· 5μ 1，20μΜ 的 LC014901 μ 1、20μΜ 的 HC021981 μ 1，基因組 DNA3 μ 1，ddH20 補足至 50 μ I ; 步驟（3)中所述的 PCR 反應的條件為：94°C 3min ;94°C 30s、50°C 30s、72°C 30s，20 個 循環(huán)；72°C IOmin。
3. 根據(jù)權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟⑶中所述 的將PCR產(chǎn)物純化通過如下步驟實現(xiàn)：將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，切下含目的基因條帶的凝 膠，提取目的基因。
4. 根據(jù)權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟⑷中所述 可視化擴增的體系為10XPCR buffer5y 1，每種脫氧核苷酸濃度為2. 5mM的dNTP2y 1，濃 度為 5υ/μ 1 的 DNA Polymerase I 酶 0· 5μ 1，20μΜ 的 LC014901 μ 1，20μΜ 的探針 Ι4μ 1， COI 序列 1 μ 1，ddH20 補足至 50 μ I ; 步驟（4)中所述可視化擴增的條件為941：31^11;941：308、501：308、721：458,30個循 環(huán)。
5. 根據(jù)權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟（5)中所述 的空白沉默液為濃度為I. 714M的NaCl溶液。
6. 根據(jù)權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟（5)中所述 的變性的條件為：95°C保溫5min ; 步驟（5)中所述的復性的條件為：變性后以1°C /min的速度降溫至25°C保溫30min ; 步驟（5)中所述的反應的條件為25°C保溫60min ; 步驟（5)中所述的觀察顏色變化的觀察時間為2min。
7. 根據(jù)權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟（5)中 各成分的用量如下：每50μ1可視化擴增產(chǎn)物加入0.012mol NaCl、0.108ymol hemin、 0· 126mmol H2O2 和 0· 126mmol ABTS2'
8. -種實現(xiàn)上述可視化鑒定美洲大蠊的方法的試劑盒，其特征在于：包含探針I(yè) ;探針 I的序列如下： - [ccctaccca]. aactttattactagctagtagtatagtagaaagaggtgccgg A TGGGTAGGGCGGGTTGGG 3,； 其中，方框框住部分為前綴序列；與劃橫線部分序列反向互補，起到沉默空白的作用； 粗體字部分為G-四聯(lián)結(jié)構。
9. 根據(jù)權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：還包含如下引物對： LC01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ； HC02198 :5, -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。
10. 根據(jù)權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包含陽性對照、酶、 dNTP和反應緩沖液中的至少一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種可視化鑒定美洲大蠊的方法及試劑盒。本發(fā)明設計如SEQ ID NO.1所示的美洲大蠊的可視化探針序列，該探針的前綴序列和部分G-四聯(lián)結(jié)構互補。本發(fā)明通過提取待檢標本的基因組DNA，然后以LCO1490和HCO2198為引物對進行PCR反應，得到COI序列；再通過LCO1490和探針I(yè)為引物對，以COI序列為模板，進行PCR反應；向得到的可視化擴增產(chǎn)物中加入NaCl溶液，變性和復性；接著加入氯鐵血紅素反應，再加入H2O2和ABTS2-，觀察顏色變化，顏色變?yōu)榫G色，表示待檢樣品為美洲大蠊，顏色沒有發(fā)生變化，表示待檢樣品非美洲大蠊。本發(fā)明的試劑盒包含前述可視化探針序列。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104651486
【申請?zhí)枴緾N201410396082
【發(fā)明人】胡佳, 岳巧云, 邱德義, 陳健, 吳可量, 劉德星, 魏曉雅
【申請人】岳巧云
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年8月12日