食物中毒菌的培養(yǎng)基及食物中毒菌的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及培養(yǎng)食物中毒菌的技術(shù)，尤其涉及在同一培養(yǎng)基中同時培養(yǎng)多種食物 中毒菌的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，每年會發(fā)生超過千件的食物中毒事件。在發(fā)生食物中毒事件的情況下，為 了對成為原因的食物中毒菌進行確定，要進行增殖對象菌以判定其種類的操作。在增殖對 象菌時，基于保健站的技師的經(jīng)驗，對被推測為原因的對象菌全部進行單一培養(yǎng)。該單一培 養(yǎng)中，需要對每種對象菌考慮多種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等。
[0003] 在這種現(xiàn)有方法中，存在食物中毒菌的培養(yǎng)及其檢測需要花費大量的時間和成 本、勞力的問題。
[0004] 因此，以食物中毒菌的培養(yǎng)及檢測中的省力化及迅速化、減少消耗品廢棄為目的， 正在研究開發(fā)在同一培養(yǎng)基中同時培養(yǎng)多種食物中毒菌的技術(shù)。
[0005] 例如，根據(jù)專利文獻1中記載的方法，能夠同時培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、 大腸桿菌、弧菌、蠟狀芽孢桿菌及李斯特菌這6種食物中毒菌。
[0006] 另外，在專利文獻2中記載的方法中，記載了能夠同時培養(yǎng)包含難以增殖的李斯 特菌在內(nèi)的多種食物中毒菌。
[0007] 專利文獻1 :日本特開2008-48670號公報
[0008] 專利文獻2 :日本專利第4621919號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明要解決的課題
[0010] 但是，專利文獻1中使用的培養(yǎng)基存在難以穩(wěn)定地培養(yǎng)對象菌的問題。特別是，在 含有倍增速率快的對象菌或雜菌等非對象菌的情況下，存在會因其影響而使一部分對象菌 的倍增速率變慢、無法適當增殖的問題。
[0011] 另外，專利文獻2中使用的培養(yǎng)基存在無法充分增殖金黃色葡萄球菌、無法適當 地檢測出金黃色葡萄球菌的問題。
[0012] 此外,專利文獻1及2中，目的在于使對象菌增殖為103cfu/ml以上，因此，存在對 于用于迅速檢驗法等而言靈敏度不足、缺乏通用性的問題。
[0013] 于是，本發(fā)明人進行了深入研究，成功開發(fā)出了能夠同時增殖在食品檢驗、流行病 學環(huán)境檢驗、環(huán)境檢驗及臨床試驗、家畜衛(wèi)生中重要的4種食物中毒細菌即大腸桿菌、沙門 氏菌、金黃色葡萄球菌、及副溶血弧菌的培養(yǎng)基。
[0014] 此處，一般的迅速檢驗法（免疫層析法、ELISA法等）的檢測下限為105cfu/ml，因 此，若考慮作為這些檢驗法的培養(yǎng)基進行利用的情況，則希望在實用的培養(yǎng)時間內(nèi)將對象 菌增殖為10 5cfu/ml以上。另外，對于食物中毒菌來說，在生物化學試驗中需要進行毒素產(chǎn) 生的評價，在過去的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌的食物中毒發(fā)生事 例中,對象菌以105cfu/ml以上存在時會產(chǎn)生毒素，引起食物中毒。因此，從這種觀點出發(fā)， 也希望將對象菌增殖為105cfu/ml以上。
[0015] 此外，在同時檢驗多種食物中毒菌時，不同種類的食物中毒菌間的菌數(shù)之差很重 要。即，在使用了多重PCR等的迅速檢驗法中，若菌數(shù)之差高至10 3cfu/ml以上，則在同時 擴增多種食物中毒菌的情況下，相對較少的菌無法適當?shù)財U增，難以檢測。因此，希望按照 菌數(shù)之差小于10 3cfu/ml的方式使其增殖。
[0016] 本發(fā)明是鑒于上述情況進行的，其目的在于提供能夠同時適當?shù)卦鲋嘲瘘S色 葡萄球菌的多種食物中毒菌的食物中毒菌的培養(yǎng)基、以及食物中毒菌的檢測方法。
[0017] 用于解決課題的方案
[0018] 為了達到上述目的，本發(fā)明的食物中毒菌的培養(yǎng)基的構(gòu)成為：含有蛋白胨、酵母提 取物及硫酸鎂。
[0019] 另外，本發(fā)明的食物中毒菌的檢測方法為下述方法：利用含有蛋白胨、酵母提取物 及硫酸鎂的培養(yǎng)基，使至少包含金黃色葡萄球菌的多種食物中毒菌同時增殖，由所增殖的 食物中毒菌提取DNA，將用于對食物中毒菌的DNA的擴增對象區(qū)域進行特異性擴增的引物 加入至PCR用溶液，通過PCR使擴增對象區(qū)域擴增，對所得到的擴增產(chǎn)物進行檢測。
[0020] 發(fā)明的效果
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，能夠利用同一培養(yǎng)基同時適當?shù)卦鲋嘲瘘S色葡萄球菌的多種食 物中毒菌。
【附圖說明】
[0022] 圖1是示出對本發(fā)明實施方式的合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸鎂的培養(yǎng)基進 行了驗證的試驗1的結(jié)果的圖。
[0023] 圖2是示出對本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)基的最佳蛋白胨濃度進行了驗證的試驗2的 結(jié)果的圖。
[0024] 圖3是示出對本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)基的最佳氯化鈉濃度進行了驗證的試驗3的 結(jié)果的圖。
[0025] 圖4是示出對本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)基的最佳糖濃度進行了驗證的試驗4的結(jié)果 的圖。
[0026] 圖5是示出對本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)基的最佳pH進行了驗證的試驗5的結(jié)果的 圖。
[0027] 圖6是示出對利用本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)基和現(xiàn)有培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)束時的菌數(shù) 進行了驗證的試驗6的結(jié)果的圖。
[0028] 圖7是示出對在本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)基中混入有雜菌時的培養(yǎng)基進行了驗證 的試驗7的結(jié)果的圖。
[0029] 圖8是示出對在本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)基中添加了食品時的培養(yǎng)基進行了驗證 的試驗8的結(jié)果的圖。
[0030] 圖9是示出用于對各試驗中使用的食物中毒菌的DNA中的擴增對象區(qū)域進行特異 性擴增的引物的堿基序列的圖。
[0031] 圖10是示出通過電泳檢測利用試驗1中培養(yǎng)的食物中毒菌的DNA進行多重PCR 所得到的特異性擴增產(chǎn)物的結(jié)果的圖。
[0032] 圖11是示出通過電泳檢測利用試驗3中培養(yǎng)的食物中毒菌的DNA進行多重PCR 所得到的特異性擴增產(chǎn)物的結(jié)果（氯化鈉濃度〇~1. 5% )的圖。
[0033] 圖12是示出通過電泳檢測利用試驗3中培養(yǎng)的食物中毒菌的DNA進行多重PCR 所得到的特異性擴增產(chǎn)物的結(jié)果（氯化鈉濃度2. 0~3. 5% )的圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面，對本發(fā)明實施方式的食物中毒菌的培養(yǎng)基及食物中毒菌的檢測方法進行詳 細說明。
[0035] 本發(fā)明實施方式的食物中毒菌的培養(yǎng)基的特征在于，其含有蛋白胨、酵母提取物 及硫酸鎂。根據(jù)本實施方式的食物中毒菌的培養(yǎng)基，通過這種構(gòu)成，可以同時增殖至少包含 金黃色葡萄球菌的多種食物中毒菌，尤其可以同時適當?shù)卦鲋炒竽c桿菌、沙門氏菌、金黃色 葡萄球菌及副溶血弧菌。
[0036] [檢測對象菌]
[0037](大腸桿菌）
[0038] 大腸桿菌（Escherichia coli)是革蘭氏陰性、兼性厭氧性的桿菌。其為腸內(nèi)細 菌的一種，大多大腸桿菌是無害的，但是存在一部分會引起腹痛或腹瀉等的大腸桿菌，這 些被稱為致病性大腸桿菌。0157等有名的腸出血性大腸桿菌（EHEC、enterohemorrhagic Ε· coli)的生長pH(最佳pH)為4. 4~9. 0(6. 0~7. 6)、生長溫度（最佳溫度）為7. 0~ 46. 0 (35~40)。作為培養(yǎng)基，一般使用mEC培養(yǎng)基。
[0039] (沙門氏菌）
[0040] 沙門氏菌（Salmonella sp.)是革蘭氏陰性、兼性厭氧性的桿菌，是腸內(nèi)細菌的一 種，存在一部分會引起感染型食物中毒的沙門氏菌。沙門氏菌的生長pH(最佳pH)為3. 8~ 9. 5 (7. 0~7. 5)、生長溫度（最佳溫度）為5. 2~46. 2 (35~43)。作為培養(yǎng)基，一般使用 緩沖蛋白胨水溶液。
[0041] (金黃色葡萄球菌）
[0042] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是葡萄球菌的一種，為革蘭氏陽性、兼 性厭氧性的球菌。常存在于人體的皮膚或鼻腔、腸內(nèi)，對健康人類也會引起疾病，但如果菌 少的話，通常其毒性較弱。除了引起食物中毒外，還是表皮感染癥、肺炎、腦膜炎等各種感 染癥的病因菌。金黃色葡萄球菌的生長pH (最佳pH)為4. 2~9. 3 (7.0~7. 5)、生長溫度 (最佳溫度）為6. 5~46. 0 (30~37)。作為培養(yǎng)基，一般使用添加了食鹽的胰蛋白胨大豆 肉湯培養(yǎng)基（tryptic soy broth medium) 〇
[0043] (副溶血弧菌）
[0044] 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)是革蘭氏陰性、嗜鹽性的桿菌。主要生 活在海水中，若人感染副溶血弧菌，則會發(fā)生食物中毒。副溶血弧菌的生長pH(最佳pH)為 5. 5~9. 6 (7. 6~8. 0)、生長溫度（最佳溫度）為10. 0~43. 0 (35~37)。作為培養(yǎng)基，一 般使用堿性蛋白胨水溶液。
[0045] 在這些食物中毒菌中，只有金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性,與革蘭氏陰性菌相比， 革蘭氏陽性菌的增殖速度慢，因此，以往非常難以利用同一培養(yǎng)基同時對它們進行培養(yǎng)。
[0046] 即，若利用同一培養(yǎng)基同時培養(yǎng)這些多種食物中毒菌，貝U大腸桿菌和沙門氏菌先 大量增殖，其結(jié)果，金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌的生長受到抑制，尤其存在金黃色葡萄球 菌無法充分增殖的問題。另外，副溶血弧菌的生長需要氯化鈉，但培養(yǎng)基中的氯化鈉濃度對 其它菌的生長也有影響。
[0047] 因此，為了能夠均衡地進行這4種菌種的增殖，本發(fā)明實施方式的食物中毒菌的 培養(yǎng)基在培養(yǎng)基的組成方面進行了鉆研。
[0048]