誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽的植物表達(dá)載體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于柑桔品質(zhì)改良技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽的植物表達(dá)載體及 其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔潰瘍病是一種世界性病害，發(fā)生于亞洲的幾乎每一個柑桔生產(chǎn)國以及除了地 中海國家以外的其它地區(qū)。柑桔潰瘍病細(xì)菌主要危害新葉、嫩枝和未成熟的果實，嚴(yán)重時落 葉、枯枝、落果，樹勢衰弱，產(chǎn)量降低，果實品質(zhì)變劣，一旦疫情在柑桔主產(chǎn)區(qū)傳播蔓延，對柑 桔產(chǎn)業(yè)具有毀滅性、災(zāi)難性打擊。目前，世界各國尚不能通過藥劑或人工摘葉等方式來完全 根治柑桔潰瘍病害，而只能采取鏟除發(fā)病植株及其周邊一定區(qū)域內(nèi)的柑桔植株等一系列措 施，來徹底清除潰瘍病菌寄主和根除柑桔潰瘍病，為此，對果農(nóng)來說，經(jīng)濟(jì)損失非常嚴(yán)重。
[0003] 隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，許多柑桔品種的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已被成功建立， 于此同時許多功能基因已被成功導(dǎo)入柑桔基因組中，獲得了許多性狀改良的轉(zhuǎn)基因材料： 陳善春等（1996)將柞蠶抗菌肽D基因轉(zhuǎn)化錦橙、新會橙和沙田柚；羅賽男等（2008)用 TERF1基因提高了冰糖橙抗?jié)儾〉哪芰?；Cardoso等（2010)用人抗菌肽基因attacinA 轉(zhuǎn)化甜橙并獲得了抗柑桔潰瘍病的株系；Mendes等（2010)用水稻抗白葉枯病基因Xa21 轉(zhuǎn)化4個甜橙品種并獲得部分抗?jié)儾〖?xì)菌的株系；Li等（2011)將潰瘍病細(xì)菌無毒基因 PthA的NLS序列導(dǎo)入甜橙中，提高了柑桔抗?jié)儾〉哪芰?；He等（2011)將抗菌肽Cecropin B和ShivaA雙價基因轉(zhuǎn)入錦橙和甜橙中并獲得對潰瘍病細(xì)菌有顯著抗性的株系。上述 抗性基因的表達(dá)策略主要由CaMV35S組成型啟動子控制。抗性基因的組成型表達(dá)往往會 對植物帶來諸如持續(xù)激活植物在逆境條件下才合成的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物、打破植物體內(nèi)激 素平衡、連續(xù)刺激系統(tǒng)免疫應(yīng)答反應(yīng)等不利影響；而且其安全性、專一性和表達(dá)效率存在問 題。
[0004] 利用病原物誘導(dǎo)啟動子控制抗病基因一直是植物抗病基因工程育種研宄的一大 熱點。該策略具有如下優(yōu)點：①在無相應(yīng)的病原微生物浸染時，抗病基因保持沉默，不會對 植物造成任何不利影響；②當(dāng)植物受到病原微生物入侵時，病原物誘導(dǎo)啟動子能立即驅(qū)動 抗病基因在浸染位點表達(dá)，植物防衛(wèi)反應(yīng)隨即啟動，有關(guān)保護(hù)蛋白基因亦被激活，并能迅速 有效地抵抗病原微生物的侵害；③抗性基因在病原物誘導(dǎo)啟動子控制下，在植物的非侵染 部位可以保持沉默，因而能有效避免抗菌蛋白可能帶來的食用安全問題（如轉(zhuǎn)基因果實的 食用安全）；④因此，相對其它類型啟動子，利用病原物誘導(dǎo)啟動子調(diào)控抗性基因的表達(dá)更 有利于轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)濟(jì)有效使用體內(nèi)物質(zhì)和能量、提高抗性和產(chǎn)量。
[0005] 目前，還沒有關(guān)于利用病原物誘導(dǎo)啟動子控制抗菌肽基因提高柑桔抗性的研宄報 道?？赡艿脑蛟谟冢阂?、大多數(shù)病原物誘導(dǎo)啟動子的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CaMV35S等組成型強(qiáng) 啟動子；二、抗菌肽作為外源小分子肽，在植物細(xì)胞內(nèi)極易被胞內(nèi)蛋白酶降解而活性大大降 低。因此，病原物誘導(dǎo)啟動子指導(dǎo)抗菌肽的表達(dá)水平往往難于到達(dá)殺菌效果，無法有效提高 轉(zhuǎn)基因植株的抗性水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為改良柑桔潰瘍病抗性提供一種新選擇。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽的表達(dá)框架，采用柑桔潰瘍病病原菌高效誘 導(dǎo)表達(dá)啟動子調(diào)控天蠶素抗菌肽的表達(dá)。
[0008] 優(yōu)選的，所述的天蠶素抗菌肽為植物細(xì)胞間隙分泌型天蠶素抗菌肽，其核苷酸序 列如SEQIDNo. 10所示。
[0009] 具體的，所述的啟動子為煙草病原物誘導(dǎo)啟動子PPP1、馬鈴薯病原物誘導(dǎo)啟動子 gstl或煙草病原物誘導(dǎo)啟動子hs203J;啟動子PPP1的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示；啟 動子gstl的核苷酸序列如SEQIDNo. 6所示。
[0010] 優(yōu)選的，所述啟動子為PPP1。
[0011] 本發(fā)明還提供了還有所述表達(dá)框架的植物表達(dá)載體。
[0012] 具體的，采用PPP1啟動子的植物表達(dá)載體中所包含的T-DNA具有如SEQIDNo. 18 所示的核苷酸序列；采用gstl啟動子的植物表達(dá)載體中所包含的T-DNA具有如SEQID No. 19所示的核苷酸序列。
[0013] 本發(fā)明還提供了含有所述植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0014] 優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述植物表達(dá)載體在改良柑桔潰瘍病抗性中的用途。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的宿主細(xì)胞在改良柑桔潰瘍病抗性中的用途。
[0017] 本發(fā)明還提供了增強(qiáng)柑桔潰瘍病抗性的方法，包括如下步驟：將所述誘導(dǎo)表達(dá)抗 菌肽的植物表達(dá)載體通過遺傳轉(zhuǎn)化柑桔，獲得對潰瘍病抗性增強(qiáng)的柑桔。
[0018] 本發(fā)明中，植物表達(dá)載體中的T-DNA的兩端為介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的左邊界和右邊界， 在左邊界和有邊界之間為誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽的表達(dá)框架和篩選基因表達(dá)框架。在應(yīng)用中，可 根據(jù)需要將該T-DNA構(gòu)建到不同的植物表達(dá)載體骨架上，構(gòu)建得到本發(fā)明植物表達(dá)載體， 發(fā)揮增強(qiáng)柑桔對潰瘍病抗性作用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過利用潰瘍病病原菌高效誘導(dǎo)啟動子指導(dǎo)抗菌肽等 抗性基因在病原菌入侵部分的高效表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)柑桔潰瘍病的抗性水平。最終通過病原 誘導(dǎo)啟動子驅(qū)動抗菌肽等基因增強(qiáng)柑桔對潰瘍病病原微生物侵害的誘導(dǎo)性防疫反應(yīng)，對于 提高柑桔抗病性和產(chǎn)量具有十分重要的理論和經(jīng)濟(jì)價值。本發(fā)明通過將潰瘍病高效啟動子 調(diào)控下的抗菌肽基因mAATCB整合到柑桔基因組中，實現(xiàn)了抗菌肽基因在柑桔受潰瘍病病 原菌入侵時迅速高水平表達(dá)；從而增強(qiáng)了柑桔潰瘍病抗性。
【附圖說明】
[0020] 圖1載體pC-PPPl-mAATCB的構(gòu)建路線圖。
[0021] 圖2載體pC-gstl-mAATCB的構(gòu)建路線圖。
[0022] 圖3載體pC-hs203J-mAATCB的構(gòu)建路線圖。
[0023] 圖1~3中：Kanamycin，卡那霉素抗性基因；Amp，氨芐青霉素抗性基因；NPTII，新 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；GUS，葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S(35S)，來源于花椰菜花葉病 毒的植物組成性啟動子；nos，冠癭堿合成酶基因終止子。用于構(gòu)建植物表達(dá)載體的骨架載 體為PCAMBIA1305. 1基礎(chǔ)上改造的pC載體，具有CaMV35S啟動子調(diào)控下的⑶S基因， 便于在植物遺傳轉(zhuǎn)化的過程中對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行GUS染色的篩選。
[0024] 圖4外源基因在轉(zhuǎn)基因柑桔中的PCR驗證。提取柑桔葉片DNA，PCR檢測抗菌肽基 因在柑桔基因組中的整合。A:PPPl-mAATCB轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR驗證；B:gstl-mAATCB轉(zhuǎn)基因植 株P(guān)CR驗證；C:hs203J-mAATCB轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR驗證；M:DNAmarker;WT:野生型對照；1~ 12:轉(zhuǎn)基因植株；P:以質(zhì)粒為模板進(jìn)行的PCR。
[0025] 圖5外源基因在轉(zhuǎn)基因柑桔中的Southernblot分析。15個轉(zhuǎn)基因植株的基因組 DNA經(jīng)HindllI酶切后，用mAATCB-nos基因片段進(jìn)行Southern雜交。在不同的株系中得到 了不同大小和不同數(shù)量的雜交片段。野生型對照中沒有雜交信號。1~5為hs203J-mAATCB 轉(zhuǎn)基因植株；6~10為PPPl-mAATCB轉(zhuǎn)基因植株；11-15為gstl-mAATCB轉(zhuǎn)基因植株；WT為 野生型對照。
[0026]圖6mAATCB在轉(zhuǎn)基因柑桔PPPl-mAATCB(A)、gstl-mAATCB(B)、hs203J-mAATCB(C)、 中受柑桔潰瘍病病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的Real-timePCR定量分析。
[0027] 分別用水和柑桔潰瘍病病原菌Xac菌液處理植株葉片24h，然后提葉片總RNA， real-timePCR定量分析抗菌肽基因的表達(dá)水平，以水處理為對照，計算潰瘍病病原菌誘導(dǎo) 抗菌肽基因的相對表達(dá)水平（即誘導(dǎo)倍數(shù)）。結(jié)果顯示在PPPl-mAATCB(A)轉(zhuǎn)基因植株中抗 菌肽基因的相對表達(dá)水在3-17倍之間，明顯高于其在gstl-mAATCB(B)轉(zhuǎn)基因植株中的相 對表達(dá)水平，而在hs203J-mAATCB(C)轉(zhuǎn)基因植株中沒有檢測到抗菌肽基因的表達(dá)。WT:野 生型柑桔。
[0028] 圖7轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病抗性比較
[0029] 離體針刺法接種潰瘍病實驗，與野生型對照相比，分別統(tǒng)計分析接菌5天和10天 針刺點發(fā)病率（A)和病情指數(shù)（B)。結(jié)果顯示，？?？1-1^4!1^(?5、？72、？124、？193)對潰瘍病 的抗性顯著強(qiáng)于野生型對照；gstl-mAATCB(G3、G5、G10)轉(zhuǎn)基因植株中在接菌5天時抗性顯 著強(qiáng)于野生型，但10天后，大部分轉(zhuǎn)基因植株與對照無顯著差異；hs203J-mAATCB(H9,H60) 轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病抗性與對照無顯著差異。WT:野生型柑桔；5DAI:接菌后5天；5DAI:接菌 后10天。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明實施例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體 說明的均參考《分子克隆實驗指南》（Sambrook和Russell, 2001)。
[0031] 下述為本發(fā)明實施例中所涉及到實驗操作介紹。
[0032] 1.DNA的提取
[0033]柑桔、馬鈴薯、煙草的基因組提取均使用Aidlab公司試劑盒（cat.No.DN15)，提取 的基因組DNA于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 質(zhì)粒DNA的提取使用OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒（cat.No.D6943-01*)。
[0035] 2.RNA的提取及cDNA的合成
[0036] 選取柑桔葉片0?lg用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（Aidlab,cat.No.RN09) 提取葉片總RNA，用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量。cDNA 第一鏈的合成按照BIO-RADiScriptTMcDNASynthesisKit(BIO-RAD,cat.No. 170-8891) 說明書進(jìn)行。合成的cDNA于-20保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 3.基因組序列的PCR擴(kuò)增
[0038] 擴(kuò)增體系：10XExPCRbuffer(Mg2+free)2. 5yL，2. 5mmol/LdNTPs2yL， 25臟〇1/1]\%(：122 1^，引物1(5 11111〇1/1)11^，引物2(5 11111〇1/1)11^，￡叉1&9〇嫩聚合酶 1U，基因組DNA約 60ng，加ddH20 至 25yL。
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