一種胎盤造血干細胞的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體的說是涉及一種胎盤造血干細胞的制備方法。
【背景技術】
[0002] 造血干細胞（HemopoieticStemcell，HSC)是存在于造血組織中的一群原始造血 細胞，它不是組織固定細胞，可存在于造血組織及血液中。造血干細胞是所有造血細胞和免 疫細胞的起源，具有自我更新和多向分化能力。它的基本特性是具有自我更新能力，即經(jīng)過 一個細胞周期活動之后，可以產(chǎn)生兩個與分裂前性質(zhì)相同的造血干細胞，同時又具有多向 分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細胞具有向各系血細胞分化的能力。
[0003] 隨著對造血干細胞（HSC)日漸深入的研宄，HSC移植已經(jīng)成為治療許多惡性血液 系統(tǒng)疾病及其他腫瘤的有效手段。目前，HSC的主要來源是骨髓、外周血及臍血，骨髓和外 周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康狀態(tài)影響，而臍血HSC數(shù)量有限，這些限 制因素使其不能滿足日漸增長的HSC臨床應用需求。近年來，國內(nèi)外學者研宄發(fā)現(xiàn)，胎盤中 含有大量的早期干細胞，包括數(shù)量豐富的造血干細胞。這些干細胞在胎盤中行使著造血的 功能。小孩出生后剝離的胎盤內(nèi)所含的造血干細胞，是臍帶血的8-10倍，可供小孩自用幾 次，甚至可提供給多個成人患者的治療。胎盤造血干細胞的成功分離和提取可解決臨床上 HSC的來源問題，具有廣闊的臨床應用前景。
[0004] 目前，胎盤HSC的分離提取方法主要采用機械法、機械酶解法等，但這兩種方法提 取過程操作繁復、耗時長、成本高，不太適用于大規(guī)模的生產(chǎn)制備。
[0005] 中國專利CN103789262A公開了一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其 以酶解灌注法進行造血干細胞的制備，最終獲得的⑶34陽性細胞數(shù)在1. 2-1. 6X109,但 是，該方法在酶解時間極短的前提下，該效果數(shù)據(jù)基本不可能達到十億級，并且經(jīng)過對該專 利方法試驗驗證，其單個核細胞總數(shù)最高在1〇 8數(shù)量級，單個核細胞活率較低，在60-65 %， CD34陽性細胞僅在105數(shù)量級，明顯與其記載的試驗結(jié)果不相符。
[0006] 同時，從其提供的流式檢測圖可知，只有FSC/SSC檢測的細胞圖，這個流式圖代表 的是細胞檢測數(shù)量，且其提取出來的細胞并未經(jīng)過流式CD34抗原的檢測，其總提取細胞是 單個核細胞，并非CD34陽性細胞。進行流式檢測一般是對提取細胞進行重懸后（總體積V)， 取少量細胞懸液（檢測體積VI)、細胞數(shù)量約為IX106cell，進行染色后上機檢測。根據(jù)檢 測細胞中CD34陽性的細胞含量，從而計算出總細胞中含有的CD34陽性的細胞。
[0007]雖然，上述現(xiàn)有專利以酶解灌注法進行胎盤造血干細胞的制備，雖然相比機械法 和機械酶解法更簡便，耗時短、成本低，但是最終獲得的細胞數(shù)量和活力卻不夠理想，需要 進一步進行改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種胎盤造血干細胞的制備方法，使得所述制 備方法能夠提包含造血干細胞的單個核細胞數(shù)量及其活細胞數(shù)量以及CD34陽性細胞數(shù) 量。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0010] 一種胎盤造血干細胞的制備方法，包括以下步驟：
[0011] 步驟1、胎盤預處理后，用灌洗液灌注清洗胎盤；
[0012] 步驟2、將酶解液從胎盤動脈灌注至胎盤靜脈流出酶解液停止并結(jié)扎胎盤動靜脈 靜置，所述酶解液為包括I型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、枸櫞酸鹽緩沖溶液、青-鏈霉 素雙抗、罌粟堿、N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基礎培養(yǎng)基；
[0013] 步驟3、松開胎盤動靜脈并從動脈灌注所述灌洗液，從靜脈處收集全部酶解液體， 離心取細胞沉淀，然后依次經(jīng)羥乙基淀粉法和紅細胞裂解法回收純化包含造血干細胞的單 個核細胞，重懸后獲得所述胎盤造血干細胞。
[0014] 針對現(xiàn)有酶解灌注法獲取的胎盤造血干細胞數(shù)量以及活率不高的問題，本發(fā)明 從改進酶解液組成出發(fā)，以多種適宜的組分組成全新的酶解液，使其不僅能夠動員胎盤內(nèi) 部的造血干細胞并在短時間內(nèi)迅速進入血液循環(huán)系統(tǒng)，同時提高了造血干細胞的數(shù)量和活 率，解決了現(xiàn)有技術的問題。
[0015] 本發(fā)明所用胎盤由某醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性 且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術前準備無菌聚苯乙 烯胎盤采集盒作為運送容器，內(nèi)裝胎盤保存液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分 離制備胎盤造血干細胞。
[0016] 本發(fā)明技術方案中所用試劑均市售獲得，例如DMEM高糖基礎培養(yǎng)基可購自于 Gibco公司。
[0017]作為優(yōu)選，步驟1所述灌洗液灌注清洗胎盤為：
[0018] 將0-4°C灌洗液灌注進胎盤中的動脈，直至胎盤內(nèi)血清清洗干凈。
[0019] 為了進一步配合所述酶解液，共同作用于胎盤制備出大量高活力的胎盤造血干 細胞，本發(fā)明所述灌洗液優(yōu)選為包括青-鏈霉素雙抗、EDTA、枸櫞酸鹽緩沖溶液、罌粟堿和 N-乙酰半胱氨酸的PBS緩沖液；更優(yōu)選地，所述灌洗液為包括1-3倍的青-鏈霉素雙抗、 0? 01-0. 04% (質(zhì)量百分比）EDTA、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、0? 01-0.lmg/mL的罌粟堿和 0. 5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值為7. 0的PBS緩沖液；最優(yōu)選地，所述灌洗液為包 括1倍的青-鏈霉素雙抗、〇. 02%EDTA、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、0. 05mg/mL的罌粟堿和 1. Ommol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值為7. 0的PBS緩沖液。
[0020] 本發(fā)明所述1-3倍的雙抗或1倍的枸櫞酸鹽緩沖液均為本領域常規(guī)的試劑濃度表 示方法，一般所購買的青-鏈霉素雙抗或所配置的枸櫞酸鹽緩沖液均為高倍母液，在使用 時會稀釋配置成低倍數(shù)，如所購買的青-鏈霉素雙抗多數(shù)為100倍，而枸櫞酸鹽緩沖液一般 配制成5倍或10倍，其配制方法如磷酸緩沖液屬于本領域公知，作為優(yōu)選，本發(fā)明提供5倍 枸櫞酸鹽緩沖液配制方法，如下：
[0021] 稱取枸櫞酸鈉粉末26. 3g、枸櫞酸粉末3. 27g、葡萄糖12. 7g、磷酸二氫鈉4. 44g、腺 嘌呤0. 55g，把上述各組分溶于400mL的去離子水中，充分攪拌混勻后形成5倍枸櫞酸鹽緩 沖溶液，0.22ym過濾，分裝。
[0022] 在本發(fā)明所述制備方法的起始階段，需要對胎盤進行預處理，這一措施屬于本領 域公知，即對胎盤進行消毒、除去胎盤羊膜以及洗滌等步驟，在制備造血干細胞前，本領域 技術人員均知曉這些預處理步驟并能夠根據(jù)實際情況選擇具體的預處理步驟。作為優(yōu)選， 本發(fā)明預處理為剝離羊膜并用灌洗液清洗胎盤。
[0023] 作為優(yōu)選，所述酶解液為包括0. 01-0.lmg/mL的I型膠原酶、0. 01-0.lmg/mL的 透明質(zhì)酸酶、〇. 001-0. 005% (質(zhì)量百分比）的胰蛋白酶、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、1倍的 青-鏈霉素雙抗、〇. 01-0.lmg/mL的罌粟堿、0. 5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖 基礎培養(yǎng)基。
[0024] 更優(yōu)選地，所述酶解液為包括0. 05mg/mL的I型膠原酶、0. 02mg/mL的透明質(zhì)酸 酶、0.001 % (質(zhì)量百分比）的胰蛋白酶、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、1倍的青-鏈霉素雙抗、 0. 05mg/mL的罌粟堿、1.Ommol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基礎培養(yǎng)基。
[0025] 作為優(yōu)選，所述羥乙基淀粉法具體步驟為：
[0026] 將細胞沉淀和羥乙基淀粉按體積比細胞沉淀：羥乙基淀粉=1:1-3的比例，用羥 乙基淀粉重懸細胞沉淀，室溫下靜置20-40min，吸取上清離心，離心后棄上清。
[0027] 作為優(yōu)選，所述紅細胞裂解法具體步驟為：
[0028] 將經(jīng)羥乙基淀粉法處理后的細胞沉淀和1倍的紅細胞裂解液，按體積比細胞沉 淀：1倍紅細胞裂解液=1:5-10的比例，用1倍的紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，渦旋振蕩 5s，室溫下裂解殘留的紅細胞lOmin，離心后棄上清獲得包含造血干細胞的單個核細胞。
[0029] 作為優(yōu)選，步驟3所述重懸以DMEM高糖基礎培養(yǎng)基重懸。
[0030] 在造血干細胞數(shù)量和活率的對比試驗中，以本發(fā)明所述制備方法和專利 CN103789262A進行對比，結(jié)果顯示，在包含造血干細胞的單個核細胞數(shù)量及其活細胞數(shù)量、 ⑶34陽性細胞數(shù)量上均顯著高于現(xiàn)有對照方法。
[0031] 由以上技術方案可知，本發(fā)明改善酶解灌注法工藝，選擇多種相互適宜的組分組 成新型酶解液應用于胎盤造血干細胞制備過程中，不僅能夠動員胎盤內(nèi)部的造血干細胞并 在短時間內(nèi)迅速進入血液循環(huán)系統(tǒng)，而且同時提高了包含造血干細胞的單個核細胞數(shù)量及 其活細胞數(shù)量以及CD34陽性細胞數(shù)量。
【附圖說明】
[0032] 圖1所示為實施例1制備的造血干細胞不加抗體的流式檢測圖（對照組）；
[0033] 其中，圖1-A為檢測單個核細胞總數(shù)的流式檢測圖，所圈區(qū)域P2即表示單個核細 胞總數(shù)所占百分比（5. 4% )，圖1-B為檢測CD34陽性細胞數(shù)的流式檢測圖，右側(cè)百分比為 CD34陽性細胞在單個核細胞中的百分比；
[0034] 圖2所示為實施例1制備的造血干細胞加抗體的流式檢測圖（檢測組）；
[0035] 其中，圖2-A為檢測單個核細胞總數(shù)的流式檢測圖，所圈區(qū)域P2即表示單個核細 胞總數(shù)所占百分比（5. 2% )，圖2-B為檢測CD34陽性細胞數(shù)的流式檢測圖，右側(cè)百分比為 CD34陽性細胞在單個核細胞中的百分比。
【具體實施方式】
[0036] 本發(fā)明實施例公開了一種胎盤造血干細胞的制備方法。本領域技術人員可以借鑒 本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技 術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施 例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品及 方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0037] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種胎盤造血干細胞的 制備方法進行詳細說明。
[0038] 實施例1 :本發(fā)明所述胎盤造血干細胞的制備方法
[0039] 選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術前經(jīng)得產(chǎn)婦 知情同意并簽署知情同意書。術前準備無菌聚苯乙烯胎盤采集盒作為運送容器，內(nèi)裝胎盤 保存液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。
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