豬圓環(huán)病毒2型elisa抗體檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測(cè)試劑盒，尤其設(shè)及一種豬圓環(huán)病毒2型化ISA抗體檢測(cè)試劑 盒，屬于動(dòng)物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV)是目前已發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。根據(jù) 其抗原性、核巧酸序列及致病性，可W分為豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus typel， PCVl)和豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2)兩種血清型。其中PCVl無(wú) 致病性，廣泛存在于豬體內(nèi)及豬源傳代細(xì)胞系中。PCV2可W引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合 征（Postweaning Multisystemic Wasting Syn化ome，PMWS)、仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎 綜合征、豬呼吸道綜合征、母豬繁殖障礙等疾病。其中PMWS對(duì)養(yǎng)豬業(yè)影響最大，主要W患畜 生長(zhǎng)緩慢、進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理?yè)p傷為特征。自1996年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)W來(lái)，PCV2 引發(fā)的疾病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，受到PCV2感染的危害 日益嚴(yán)重，因此研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的PCV2血清抗體檢測(cè)方法的需求愈發(fā)迫切。
[0003] 目前，臨床上對(duì)于PCV2的檢測(cè)，主要通過(guò)流行病學(xué)、臨床癥狀和解剖病變做出初 步判斷，但PCV2與PRRS、PPV等疾病通過(guò)簡(jiǎn)單的臨床檢查、病例剖檢等手段難W確診。因 此，確診該病還有必要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷。然而，實(shí)驗(yàn)室診斷PCV2主要依靠病毒分離培養(yǎng)、免 疫酶單層實(shí)驗(yàn)（IMPA)、原位雜交（ISH)、間接免疫巧光、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)等方法，該些 技術(shù)和方法都存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高、條件苛刻、過(guò)程復(fù)雜、需要特定的專(zhuān)業(yè)設(shè)備，大規(guī)模 推廣難度高。因此，研發(fā)操作簡(jiǎn)單、特異性好、敏感性高、可大規(guī)模推廣的PCV2血清抗體檢 測(cè)試劑盒成為預(yù)防PCV2傳播的可靠途徑之一。
[0004] PCV2基因組是一條共價(jià)閉合環(huán)狀的單股DNA組成，其中有0RF1和0RF2兩個(gè)大的 開(kāi)放閱讀框，分別編碼Rep蛋白和Cap蛋白。其中Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有4 個(gè)抗原表位，具有較好的抗原性和免疫原性，是檢測(cè)該病毒特異性抗體的理想祀抗原。由于 PCV2在體外培養(yǎng)不產(chǎn)生細(xì)胞病變，病毒增殖能力低，難于獲得高產(chǎn)量的病毒抗原用于診斷。 由于其Cap蛋白氨基端有稀有密碼子的存在，普通大腸桿菌炬L21)表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法表達(dá)。童 光志研究員等人利用大腸桿菌對(duì)截短型Cap蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，但表達(dá)量很低，并且無(wú) 法獲得全長(zhǎng)的Cap蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)全長(zhǎng) Cap蛋白的制備方法及W Cap蛋白為抗原的化ISA抗體檢測(cè)試劑盒。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研究并不懈探索PCV2全長(zhǎng)Cap蛋白 的克隆技術(shù)，意外地發(fā)現(xiàn)We. coli Rosetta (DE3)作為表達(dá)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)PCV2全長(zhǎng)Cap蛋 白的大量制備。具體地，本發(fā)明的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的制備方法，該方法包括如下步驟；提取豬圓環(huán) 病毒2型基因組，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增PCV2-Cap基因片段，利用祀T-28a載體構(gòu)建能表達(dá) PCV2-Cap基因的重組質(zhì)粒，將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli Rosetta 〇)E3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo) 表達(dá)，通過(guò)化s-tag蛋白純化高親和力鑲柱樹(shù)脂純化得到豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋；所述的 特異性引物是SEQ ID NO. 1所示的上游引物P1和SEQ ID NO. 2所示的下游引物P2。
[0008] 上游引物 P1 ; 5' -CGAGCTCATGACGTATCCAAGGAGGC-3(Sac I 酶切位點(diǎn)）
[0009] 下游引物 P2;5' -CCCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGG-3'化ind III 酶切位點(diǎn)）
[0010] 一種豬圓環(huán)病毒2型化ISA抗體檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒含有包被上述豬圓環(huán) 病毒2型核衣殼蛋白的酶標(biāo)板，W及含有樣品稀釋液、封閉液、洗漆液、酶結(jié)合物、酶底物溶 液、終止液和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述豬圓環(huán)病毒2型化ISA抗體檢測(cè)試劑盒，其中；所述的 酶標(biāo)板的包被緩沖液為0. 05M pH = 9. 6的碳酸鹽緩沖液，1L包被液中含有NasCOjl. 59g， NaHOy. 93g，蛋白包被量為每孔0. 46 y g ;所述的樣品稀釋液為含有質(zhì)量濃度1 %的脫脂奶 粉和抑=7. 4的磯酸鹽緩沖液（PBS);所述的封閉液為質(zhì)量濃度5%的脫脂奶粉；所述的 洗漆液為含體積濃度0. 05 %吐溫-20的0. 01M pH = 7. 4的PBS ;所述的酶結(jié)合物為辣根過(guò) 氧化物酶-羊抗豬IgG單抗酶結(jié)合物；所述的酶底物A溶液為雙氧水溶液，酶底物B溶液為 3. 3' -5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺溶液；所述的終止液為1M H2SO4溶液，陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照 血清放置在盒內(nèi)。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了高產(chǎn)量制備豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)全長(zhǎng)Cap蛋白 的方法，并提供了 W此PCV2全長(zhǎng)Cap蛋白為抗原的化ISA抗體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒不僅 特異性強(qiáng)、敏感性高，同時(shí)可大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明檢測(cè)原理示意圖；
[0014] 圖2為重組質(zhì)粒PMD-0RF2雙酶切電泳圖；
[0015] 圖3為表達(dá)質(zhì)粒祀T-0RF2雙酶切電泳圖；
[0016] 圖4為豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白鑒定電泳圖；
[0017] 圖5為豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白純化前后電泳圖；
[001引 圖6為豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白Western blot鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明 的保護(hù)范圍并不限于該些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0020] W下實(shí)施例中所使用的技術(shù)，除非特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī) 技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備、試劑等，除非是本說(shuō)明書(shū)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人 員可W通過(guò)公共途徑獲得的。
[0021] 實(shí)施例1 ;Cap蛋白的體外表達(dá)
[0022] 1.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0023] 根據(jù)PCV2的基因序列設(shè)計(jì)Cap蛋白的特異性引物；
[0024]上游引物 PI ;5' -CGAGCTCATGACGTATCCAAGGAGGC-3'; (Sac I 酶切位點(diǎn)）
[0025]下游引物 P2 ;5' -CCCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGG-3'化ind III 酶切位點(diǎn)）
[0026] 利用PCR方法擴(kuò)增出PCV2-ORF2基因全序列，ORF2擴(kuò)增體系；Taq酶0. 5 y L， Taq酶lOXbuffer 5化，上、下游引物各加1化，PCV2全基因組模板2化，2. 5mmol/ L (1饑？2^以加入去離子水至50yL。94°C變性3min，循環(huán)參數(shù)為；94°C30s，60°C30s， 72°C Imin，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C后延伸 lOmin。
[0027] 在長(zhǎng)波紫外燈下切下含有目的DM片段的凝膠塊，放入EP管內(nèi)，用膠回收試劑盒 回收目的DM片段。將回收到的PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下與pMD-18t載體按照 5:1的比例（摩爾比）混合，16°C連接過(guò)夜。
[002引取lOuL連接產(chǎn)物，加入到lOOuL感受態(tài)細(xì)胞D冊(cè)a中，輕輕吹打混勻，冰浴 30min，42°C水浴熱激90s，迅速移至冰浴2min，加入800 y L無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基，放入37°C 恒溫?fù)u床中18化pm震蕩培養(yǎng)45min。300化pm離屯、Imin，棄去600 y L上清，重懸沉淀后取 100化菌液涂布與Amp抗性的LB平板（100 y g/血)，正置30min后倒置平板，培養(yǎng)12~ 1她。挑取單菌落接種于Amp/LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫?fù)u床20化pm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取3ml培養(yǎng) 產(chǎn)物提質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序分析。鑒定正確的質(zhì)粒命名為PMD-0RF2 質(zhì)粒。
[0029] 用Sac I和化nd III分別雙酶切pMD-OR巧和祀T-28a載體，配置如下體系：質(zhì) 粒 DNA 20yL，Sac I 2. 5uL，Hind III 2. 5uL，10XM 5uL，（1地2〇20yL，總體積 50yL。 37°C酶切化。用DM純化試劑盒回收酶切后的OR巧基因片段和祀T-28a載體。在T4連接 酶作用下，16°C連接過(guò)夜。取10 y連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，涂布與Kan抗性的 LB平板（100 y g/mL)，培養(yǎng)12~16h。挑取單菌落，培養(yǎng)后提質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定及雙 酶切鑒定。
[0030] 通過(guò)上述步驟構(gòu)建了祀T-0RF2重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0031] 2.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
[0032] 將構(gòu)建的祀T-0RF2重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coli Rosetta〇)E3)感受態(tài)細(xì)胞。接 種于含有100 y g/mL的Kan抗性LB液體培養(yǎng)基中37°C 20化pm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，之后，按照 1:100比例接種Kan/LB液體培養(yǎng)基，37°C 20化pm培養(yǎng)約化，待ODe。。值為0. 6~0. 8時(shí)，加 入終濃度Immol/L的IPTG開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)。
[003引將誘導(dǎo)化后的菌液分裝進(jìn)