一種家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BmMFS及其融合表達(dá)和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS及其融合表達(dá)和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膜蛋白在生物的生命活動(dòng)中扮演重要角色，作為受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道蛋白，參與細(xì)胞黏附、信號(hào)通路以及一系列的代謝途徑?；蚪M研究表明，膜蛋白大約占基因產(chǎn)物的30%，其中半數(shù)以上可作為藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)已解析結(jié)構(gòu)的蛋白中，膜蛋白只占到0.5%左右。膜蛋白天然含量低，疏水性極強(qiáng)，通常需要高濃度的洗滌劑才能溶于水。這對(duì)天然膜蛋白的分離純化造成了很大的困難，導(dǎo)致后續(xù)的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)解析不能順利進(jìn)行。因此提高膜蛋白的表達(dá)量并且建立易于分離純化的方法對(duì)于膜蛋白的研究至關(guān)重要。利用基因工程方法表達(dá)重組膜蛋白仍然是研究膜蛋白的另一條有效的途徑。大腸桿菌是膜蛋白表達(dá)時(shí)最常用的表達(dá)宿主，但是仍然存在膜蛋白不表達(dá)或表達(dá)量極低的情況。
[0003]多角體蛋白是昆蟲桿狀病毒感染昆蟲后晚期高效表達(dá)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多角體蛋白是以包涵體的形式存在的，在PH10.8及以上的條件下溶解，具有和天然多角體蛋白晶體相同的特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中已知膜蛋白數(shù)量少，分離純化難等技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白汝?MFS。
[0005]本發(fā)明還提供了上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS的融合表達(dá)及純化方法。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0007]經(jīng)家蠶蛋白庫(kù)篩選，篩選出一條家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白汝?MFS，經(jīng)TMHMM服務(wù)器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM對(duì)該蛋白進(jìn)行跨膜分析,得知此蛋白是含有六個(gè)跨膜區(qū)的膜蛋白。
[0008]上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白他MFS的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所
/Jn ο
[0009]上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS的融合表達(dá)和純化方法，是將該蛋白的編碼基因與核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的多角體片段Ph20編碼基因融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體表達(dá)融合蛋白，融合蛋白純化后經(jīng)凝血酶酶切，獲得汝?MFS蛋白。
[0010]本發(fā)明將多角體的部分片段與膜蛋白融合表達(dá)，多角體的部分片段保持了多角體蛋白的部分特性，不用再和以前使用多角體蛋白一樣必須反復(fù)調(diào)節(jié)PH值才能達(dá)到純化的目的，大大簡(jiǎn)化了純化步驟。
[0011]優(yōu)選地，所述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS的融合表達(dá)和純化，具體步驟如下: (1)設(shè)計(jì)合成引物，以CDNA為模板，PCR擴(kuò)增家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BmMFS的編碼基因；
(2)步驟(I)所得編碼基因用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與同樣經(jīng)過(guò)EcoR I和Xho I雙酶切的載體pET-32a-Ph20連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體；所述pET-32a-Ph20為pET_32a載體和多角體片段Ph20編碼基因同時(shí)經(jīng)和&oRI進(jìn)行雙酶切后再連接構(gòu)建而成；
(3)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白；
(4)步驟(3)的重組蛋白用pH值11.5的PBS攪拌溶解，再調(diào)節(jié)P H值調(diào)節(jié)至7.5^8.5，經(jīng)鎳離子親和層析進(jìn)行純化。
[0012](5)將純化后的融合蛋白用凝血酶酶切即可得到汝?MFS蛋白。
[0013]優(yōu)選地，上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BmMFS的融合表達(dá)和純化方法中，步驟(I)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4?5所示。
[0014]優(yōu)選地，上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS的融合表達(dá)和純化方法中，步驟(2)所述連接使用的連接酶為TOYOBO公司的ligat1n high，連接反應(yīng)時(shí)間為40min。
[0015]優(yōu)選地，上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS的融合表達(dá)和純化方法中，步驟(3)所述的宿主菌為Fermentas公司的產(chǎn)品疋coli Rosetta。
[0016]優(yōu)選地，上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS的融合表達(dá)和純化方法中，步驟(3)所述的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件為:在含50 μ g /mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C，220 rpm振蕩培養(yǎng)至0D600=0.5，加入終濃度為I mM的IPTG，37°C，220 rpm誘導(dǎo)表達(dá)5h。
[0017]優(yōu)選地，上述家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS的融合表達(dá)和純化方法中，步驟(4)具體操作為:收集步驟(3)的培養(yǎng)物，經(jīng)超聲破碎菌體后離心，取沉淀用pH值11.5的PBS攪拌溶解，再將PH值調(diào)節(jié)至7.5^8.5，離心取上清，經(jīng)0.45 μ m纖維素膜過(guò)濾后，加入鎳離子親和層析柱中，用20mM的咪唑水溶液洗脫雜蛋白，用濃度為200mM的咪唑水溶液洗脫獲得目的重組蛋白。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
MFS蛋白是一種次級(jí)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)底物的多樣性使得其在細(xì)胞物質(zhì)交換和能量代謝過(guò)程中起著重要作用。在最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為只在糖類的吸收過(guò)程中起作用，隨后發(fā)現(xiàn)該蛋白在藥物外排系統(tǒng)、磷酸:Na+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、有機(jī)磷:磷酸交換系統(tǒng)也發(fā)揮了重要作用。目前還沒有該類蛋白在家蠶中表達(dá)及純化的報(bào)道，本發(fā)明獲得的家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ifeMFS填補(bǔ)了這一空白。
[0019]本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，多角體蛋白自N端起的20個(gè)氨基酸殘基的片段在大腸桿菌中依然保持了多角體晶體的特性，并且在PH值回調(diào)至8.0時(shí)融合蛋白依然存在于上清中，大大簡(jiǎn)化了純化過(guò)程，提高了純化效率。本發(fā)明利用Ph20與膜蛋白融合表達(dá)的方式獲得融合蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)PH和鎳離子親和層析的方法即可獲得純度較高的重組蛋白，克服了天然膜蛋白表達(dá)量低、分離純化難以及利用基因工程方法難表達(dá)跨膜區(qū)多的膜蛋白的問題。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是本發(fā)明BmWS基因的PCR擴(kuò)增回收結(jié)果圖；M:DNA Ladder Mix ;1:第2次PCR擴(kuò)增條帶。
[0021]圖2是本發(fā)明pET-32a-Ph20-汝?MFS重組表達(dá)載體的PCR和雙酶切鑒定圖:M:DNALadder Mix ；1:PCR的產(chǎn)物；2:雙酶切的產(chǎn)物。
[0022]圖3是本發(fā)明重組融合蛋白的表達(dá)圖:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:pET-32a空載體誘導(dǎo)對(duì)照；2.pET-32a-汝?MFS 未誘導(dǎo)；3.pET_32a_汝?MFS 誘導(dǎo)；4.pET_32a_Ph20-汝?MFS 未誘導(dǎo)；5.pET-32a-Ph20-汝?MFS 誘導(dǎo)。
[0023]圖4是本發(fā)明重組融合蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)pH進(jìn)行純化的情況；M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.超聲后上清；2.pH8.0上清；3.pH8.0沉淀；4.pH9.0上清；5.pH9.0沉淀；6.ρΗ10.0 上清；7.ρΗ10.0 沉淀；8.ρΗ11.0 上清；9.ρΗ11.0 沉淀；10.ρΗ11.5 上清；
ll.pHll.5 沉淀。
[0024]圖5是本發(fā)明重組目的蛋白通過(guò)鎳柱進(jìn)一步純化的結(jié)果。M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化后的融合蛋白。
[0025]圖6是本發(fā)明重組目的蛋白的Western blotting鑒定圖；M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；I:pET-32a空載誘導(dǎo)對(duì)照；2.pET_32a_汝?MFS未誘導(dǎo)；3.pET_32a_汝?MFS誘導(dǎo)；4.pET-32a-Ph20-汝?MFS 未誘導(dǎo)；5.pET-32a_Ph20-汝?MFS 誘導(dǎo)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑及操作手段。
[0027]生物材料及試劑來(lái)源:
pET_32a載體、限制性內(nèi)切酶&01? I和限制性內(nèi)切酶ISo I購(gòu)自Fermentas公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技公司，氨芐青霉素購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，LB培養(yǎng)基購(gòu)自O(shè)xoid公司，連接酶ligat1n high購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司，疋coli TGl感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自 Fermentas 公司，E.coli Rosetta 購(gòu)自 Fermentas 公司。
[0028]實(shí)施例1家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白汝?MFS的制備 1.BmWS的篩選
經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室家蠶蛋白庫(kù)篩選，篩選出一條家蠶主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(5M1FS)，經(jīng)TMHMM服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對(duì)該蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析,發(fā)現(xiàn)此蛋白是含有六個(gè)跨膜區(qū)的膜蛋白(是為了預(yù)測(cè)i^MFS基因表達(dá)出的蛋白是一個(gè)六次跨膜蛋白)。
[0029]2.擴(kuò)增汝?MFS的編碼基因
(I)根據(jù)^sMFS的特性，設(shè)計(jì)引物F和R，以家蠶蠶蛹cDNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增他MFS的編碼基因